野生稻抗性候選基因的篩選和克隆.pdf

1、本研究采用了茶陵野生稻、東鄉(xiāng)野生稻、小粒野生稻等3個(gè)野生稻品種與部分可轉(zhuǎn)化大片段藥用野生稻基因組文庫(kù)等材料進(jìn)行了野生稻抗性候選基因的轉(zhuǎn)化與克隆研究。研究主要結(jié)果如下： 1.東鄉(xiāng)野生稻、小粒野生稻、茶陵野生稻等3個(gè)不同野生稻品種的總DNA電泳結(jié)果表明，采用CTAB法提取野生稻總DNA可行，并且提取的DNA質(zhì)量能夠滿足野生稻基因轉(zhuǎn)化與克隆及其他分子生物學(xué)分析要求；3個(gè)不同野生稻品種的總DNA分子量相差不大，DNA片段長(zhǎng)度均在23KB

2、左右； 2.選用9對(duì)引物分別對(duì)東鄉(xiāng)野生稻、小粒野生稻與茶陵野生稻等3個(gè)不同野生稻的總DNA進(jìn)行了引物擴(kuò)增篩選，結(jié)果表明第6對(duì)(代號(hào)為WR-1、WF-1)和第10對(duì)(代號(hào)為S2、AS3)引物的擴(kuò)增效果最好，主要表現(xiàn)為帶型最清楚，非特異性擴(kuò)增也最少。因此，用第6對(duì)引物對(duì)茶陵野生稻總DNA進(jìn)行擴(kuò)增、回收、克隆及測(cè)序分析，初步得到4類不同的抗性候選基因材料；用第10對(duì)引物對(duì)東鄉(xiāng)野生稻總DNA進(jìn)行擴(kuò)增、回收、克隆，得到34個(gè)陽(yáng)性重組子；

3、 3.在用WF-1、WR-1引物對(duì)茶陵野生稻總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)并引物的用量應(yīng)該比普通特異性引物要高很多倍才能達(dá)到擴(kuò)增的效果，通過(guò)1μL(12.5μmol)、2μL(25μmol)、4μL(50μmol)、8μL(100μmol)、16μL(200μmol)等5種不同簡(jiǎn)并引物濃度的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明16μL(200μmol)的引物濃度的擴(kuò)增效果最好，其電泳帶型最清楚，非特異性的擴(kuò)增也最少，結(jié)果符合簡(jiǎn)并引物合成原則即簡(jiǎn)

4、并性要好且簡(jiǎn)并性不能太高； 4.通過(guò)WF-1、WR-1引物對(duì)藥用野生稻的可轉(zhuǎn)化大片段基因組BIBAC2文庫(kù)編號(hào)為117的384孔板進(jìn)行抗性候選基因的篩選，篩選出117M18，117M19，117M22，117N2，117N5等五個(gè)克隆，選出117M18與117N5進(jìn)行回收、連接及測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)克隆序列的同源性高達(dá)99.8﹪，并且與從茶陵野生稻里得到的4類抗性候選基因中的CL17那一類的同源性也高達(dá)99.6﹪。通過(guò)在NCBI

5、網(wǎng)站里Blast搜索得知：它與粳稻第三號(hào)染色體上的DP000009.1(GI：73746173)存在高度的同源性； 5.同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們還得知許多根據(jù)抗性基因保守序列設(shè)計(jì)的引物都能擴(kuò)增得出構(gòu)建基因文庫(kù)所用的BIBAC2空載體； 6.對(duì)藥用野生稻可轉(zhuǎn)化大片段基因組文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404，得到164個(gè)攜帶藥用野生稻基因組片段的農(nóng)桿菌LBA4404菌種，從中挑選了117K6，117K8，117K9，117K10