稻水象甲G蛋白α亞基基因的克隆、表達(dá)分析和相互作用蛋白的篩選.pdf

1、稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus kuschil)原產(chǎn)于北美,20世紀(jì)70年代入侵亞洲以來,范圍不斷擴(kuò)大,是一種重要的水稻害蟲。
　　 昆蟲嗅覺和味覺在感受氣味物質(zhì)、尋找寄主、交配等方面起著重要的作用。G蛋白偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)是生物體內(nèi)一類重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,參與了昆蟲的嗅覺、視覺和內(nèi)分泌激素等多種信號(hào)的傳導(dǎo)過程。開展昆蟲G蛋白的研究,不僅可以明確昆蟲對(duì)信號(hào)分子的感受機(jī)理;還可以了解G蛋白對(duì)昆蟲的行

2、為和生理信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用,為今后深入研究病蟲害信號(hào)傳遞機(jī)制和調(diào)控機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。
　　 本研究克隆了稻水象甲G蛋白α亞基基因的讀碼框(ORF),并對(duì)序列特征及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析,構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體pET30a/Gαo,用純化后的蛋白免疫兔子制備了多克隆抗體,同時(shí)用熒光定量PCR研究了該基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況,并利用制備的抗體將G蛋白α亞基在稻水象甲觸角進(jìn)行了免疫定位。本文構(gòu)建了稻水象甲頭部cDNA文庫(kù),并通過酵母雙雜

3、交的方法篩選與G蛋白α亞基相互作用過的蛋白。研究結(jié)果如下:
　　 1.稻水象甲G蛋白α亞基基因的克隆和序列分析。利用RT-PCR和RACE方法從稻水象甲頭部cDNA中克隆了一個(gè)G蛋白α亞基基因,Lo Gαo。該基因的ORF為1065個(gè)核苷酸,編碼354個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)的分子量為40.416kDa,等電點(diǎn)為5.34。通過多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化及相似性分析,發(fā)現(xiàn)這個(gè)G蛋白α亞基應(yīng)屬于Gαo家族,主要功能域和結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列在與其

4、他Go蛋白基本相同。我們推測(cè)。Lo Gαo的功能可能與其他已報(bào)道的Gαo蛋白相類似,可能結(jié)合相似的受體以及調(diào)控相同的下游效應(yīng)器。
　　 2.稻水象甲Gαo基因的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及其組織分布的Westernblot檢測(cè)。我們構(gòu)建了Lo Gαo基因的原核表達(dá)載體pET30a/Gαo,IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)。用原核表達(dá)的蛋白制備了兔源多克隆抗體,并用Elisa和Western blot檢測(cè)了該抗體的效價(jià)和特異性。Anti-Lo

5、Gαo抗血清的效價(jià)為2.048×106,并且Western blot結(jié)果顯示該抗體在稻水象甲各個(gè)組織的粗提液中只檢測(cè)到一條40kDa的特異性條帶,與其他G蛋白亞基沒有交叉反應(yīng)。我們制備的抗體的特異性和效價(jià)均符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求,對(duì)于Lo Gαo在稻水象甲的免疫定位提供了必要的前提。
　　 3.Real-time PCR鑒定稻水象甲Gαo基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),用相對(duì)定量的方法,我們研究了稻水象甲各器官Lo Gαo轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)

6、Lo Gαo mRNA沒有組織特異性,在各個(gè)組織都有表達(dá),但是其在觸角的表達(dá)顯著高于其他部位。觸角是昆蟲感覺系統(tǒng)的重要組成部分,行使著嗅覺、味覺等功能,該基因在觸角的高豐度表達(dá),使我們推測(cè)其可能參與嗅覺或味覺的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 4.稻水象甲觸角感器的掃描電鏡觀察,利用掃描電鏡技術(shù),我們觀察了孤雌生殖和兩性生殖稻水象甲觸角感器的類型和分布;比較了兩種生殖方式和雌雄之間的差異,并探討了各類型感器的功能,為研究稻水象甲G蛋白α亞基在嗅

7、覺感器上的定位奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.稻水象甲Gαo亞基在觸角感器中的免疫定位,利用本研究制備的anti-LoGαo多克隆抗體,用免疫膠體金標(biāo)記的方法研究了稻水象甲G蛋白αo亞基在觸角的定位情況,發(fā)現(xiàn)該亞基主要定位在毛型感器的樹突神經(jīng)中,根據(jù)本文第五章對(duì)觸角感器功能的探討,毛型感器可能是稻水象甲的味覺/嗅覺感器,該結(jié)果表明Lo Gαo可能參與稻水象甲味覺/嗅覺信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　 6.酵母雙雜交方法篩選與稻水象甲Gαo

8、相互作用的蛋白,.本文構(gòu)建了稻水象甲頭部的酵母cDNA文庫(kù),文庫(kù)的滴度為6.8×109個(gè)細(xì)胞/ml文庫(kù)(＞2.0x107個(gè)細(xì)胞/ml),符合文庫(kù)構(gòu)建的要求,可用于進(jìn)行下一步的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。用Gαo誘餌蛋白對(duì)稻水象甲頭部cDNA文庫(kù)的篩選之后,我們得到一些與α亞基相互作用的克隆,如肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈激酶(myosin light chain kinase)、載脂蛋白D(apolipoprotein D)、肌球蛋白Ⅵ(mysinⅥ)、鐵蛋白