弓形蟲棒狀體蛋白的表達及相互作用蛋白的篩選.pdf

1、弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種人獸其患寄生蟲病，剛地弓形蟲隸屬于頂復門，可寄生在除紅細胞外幾乎所有有核細胞中。據(jù)估計，全世界約三分之一的人群感染弓形蟲。隨著城市的發(fā)展、寵物飼養(yǎng)隊伍不斷地擴大，弓形蟲感染的危險性有上升趨勢。棒狀體蛋白是弓形蟲分泌至宿主細胞的主要效應因子，棒狀體蛋白定位于宿主細胞的不同部位，與宿主細胞之間存在著復雜的相互作用。該類蛋白可以通過調控膜系及骨架結構，影響宿主細胞的生物活性因子，從而阻斷其內在的防御機制，使弓形

2、蟲成功的完成入侵，寄生及增殖等一系列生理過程。
　　弓形蟲棒狀體蛋白Rop28、Rop38在速殖子階段和緩殖子階段的表達存在很大差異。本研究通過反轉錄PCR成功擴增了弓形蟲Rop28、Rop38全長基因，將擴增的基因分別克隆至原核表達載體中，成功在大腸桿菌內進行了大量表達，制備了特異性的Rop28、Rop38多克隆抗體。同時，為鑒定與Rop和Rop38相互作用的蛋白分子，構建了Rop28和Rop38真核表達載體，在293T細胞中成

3、功進行了表達。
　　本研究構建了人源成纖維細胞(HFF)和T細胞(CEM) cDNA文庫，文庫的滴度分別為，1.2×108 cfu/ml和1.38×108c fu/ml。利用構建的酵母誘餌質粒篩選HFF文庫，獲得了與Rop2B、Rop5、Rop16、Rop17、Rop32和Rop38相互作用的宿主細胞蛋白。同時，用Rop38篩選了T細胞cDNA文庫。結果顯示Rop蛋白與宿主細胞存在著廣泛的相互作用。進一步雜交實驗證實了Rop2B和

4、7種宿主蛋白存在相互作用;Rop5和7種蛋白存在相互作用;Rop16和14種蛋白存在相互作用;Rop17和7種蛋白存在相互作用; Rop32和12種宿主蛋白相互作用;Rop38和HFF文庫中11種宿主蛋白存在相互作用，與CEM文庫中20種蛋白存在相互作用。有文獻表明，過量表達Rop38能夠顯著抑制感染細胞的轉錄應答。本研究利用Rop38在HFF細胞文庫和CEM文庫均篩選到PRMT7。PRMT7是一種精氨酸甲基轉移酶，是PRMTs家族的重