篩選和鑒定與剛地弓形蟲(chóng)微線體蛋白6C端相互作用的蛋白.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，呈世界性分布。人群感染極為普遍，許多國(guó)家和地區(qū)的感染率達(dá)25％～50％。正常人群感染弓形蟲(chóng)后一般沒(méi)有明顯的臨床癥狀，但在免疫功能低下的腫瘤患者、器官移植接受者和艾滋病患者等特殊人群，感染的蟲(chóng)體可以大量增殖，引起全身播散性損害，成為患者死亡的重要原因之一。婦女在懷孕期間感染T．gondii，可將其垂直傳播給胎兒，造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和畸形等，存活的胎兒也往往有嚴(yán)重的

2、后遺癥。弓形蟲(chóng)病又是一種人獸共患病，其暴發(fā)流行對(duì)畜牧業(yè)造成極大的損失。目前弓形蟲(chóng)病的治療并無(wú)特效藥物，傳統(tǒng)的乙胺嘧啶和磺胺嘧啶因在長(zhǎng)期使用中表現(xiàn)的毒副作用使其應(yīng)用受到限制。 研究目的和意義： 有多個(gè)分子參與了弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程，如Ca2+、三種微線體復(fù)合體(MIC6-MIC1-MIC4、MIC2-M2AP和MIC3-MIC8)、棒狀體蛋白和肌動(dòng)蛋白等。其中微線體復(fù)合體和肌動(dòng)蛋白發(fā)揮著重要的作用，微線體復(fù)合體依靠其獨(dú)

3、特的黏附結(jié)構(gòu)域識(shí)別、黏附宿主細(xì)胞，肌動(dòng)蛋白為入侵提供動(dòng)力支持。已有研究證實(shí)弓形蟲(chóng)的醛縮酶與MIC2-M2AP復(fù)合體中的跨膜蛋白MIC2的C端片段相互作用，將入侵識(shí)別蛋白MIC2-M2AP復(fù)合體和動(dòng)力蛋白肌動(dòng)蛋白相連接，從而闡明了弓形蟲(chóng)入侵相關(guān)分子MIC2-M2AP復(fù)合體參與蟲(chóng)體入侵的模式。MIC6-MIC1-MIC4微線體復(fù)合體在蟲(chóng)體入侵過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用，該復(fù)合體中的跨膜蛋白MIC6是由何種蛋白介導(dǎo)與動(dòng)力系統(tǒng)的連接，目前卻未見(jiàn)相

4、關(guān)的研究報(bào)道。本研究的目的旨在篩選并鑒定與TgMIC6蛋白C端相互作用的蛋白，探討在MIC6-MIC1-MIC4微線體復(fù)合體和肌動(dòng)蛋白之間起橋梁作用的蛋白，闡明MIC6-MIC1-MIC4復(fù)合體參與蟲(chóng)體入侵的模式，為進(jìn)一步研究T．gondii的入侵機(jī)制奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，T．gondii作為一模式生物，它的入侵機(jī)制的研究可以為頂復(fù)門(mén)其它寄生原蟲(chóng)的研究提供參考。 研究方法： 1、GST—MIC6C蛋白及其多克隆抗體的制備

5、 以弓形蟲(chóng)的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MIC6C基因片段；構(gòu)建MIC6C/pGEX—4T-1重組質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST—MIC6C；親和層析純化融合蛋白，核酸蛋白儀分析蛋白濃度。融合蛋白GST—MIC6C皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫動(dòng)物(新西蘭兔和SD大鼠)，收集抗血清，親和層析純化，制備GST—MIC6C多克隆抗體。 2、篩選并鑒定與MIC6C作用的蛋白 制備弓形蟲(chóng)速殖子裂解液；以GST—MIC6C為探針蛋白、GS

6、T為對(duì)照蛋白，采用GST沉降技術(shù)從弓形蟲(chóng)速殖子裂解液中篩選蛋白，SDS—PAGE分析，蛋白條帶N端測(cè)序，BLAST2在線相似搜索，初步確定蛋白。構(gòu)建Aldolase/pET30a重組原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；親和層析純化；重組蛋白免疫動(dòng)物，收集抗血清并純化，棋盤(pán)滴定法測(cè)定純化的Aldolase—His多克隆抗體的效價(jià)。相同方法制備Actin—His蛋白及其多克隆抗體。用大鼠源性Aldolase—His多克隆抗體和Actin—His

7、多克隆抗體作為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Western blot分析GST沉降初篩產(chǎn)物，ECM法檢測(cè)。 用兔源性GST—MIC6C多克隆抗體包被protein G sepharose，兔免疫前血清為對(duì)照，與速殖子裂解液進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，SDS—PAGE分析；分別以大鼠源性GST—MIC6C多克隆抗體、Aldolase—His多克隆抗體和Aldolase—His多克隆抗體為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Weste

8、rn blot分析免疫共沉淀產(chǎn)物，ECM法檢測(cè)。 制備GST—aldolase蛋白，與Actin—His蛋白液進(jìn)行GST沉降實(shí)驗(yàn)。 3、MIC6C與Aldolase的作用位點(diǎn)及其在蟲(chóng)體內(nèi)的定位 設(shè)計(jì)MIC6C W/V突變體基因擴(kuò)增用引物，PCR擴(kuò)增MIC6C W/V突變體基因；構(gòu)建MIC6C W/V/pGEX—4T-1重組載體，誘導(dǎo)表達(dá)GST—MIC6C W/V突變體蛋白，親和層析純化蛋白。以GST—MIC6C蛋

9、白為陽(yáng)性對(duì)照，GST—MIC6C W/V突變體蛋白為探針蛋白與速殖子裂解液進(jìn)行GST沉降實(shí)驗(yàn)，SDS—PAGE；分別以大鼠源性Aldolase—His多克隆抗體和Actin—His多克隆抗體作為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Western blot分析GST沉降產(chǎn)物。相同方法制備GST—MIC2C蛋白及其多克隆抗體；制備GST—MIC2C W/A突變體蛋白。以GST—MIC2C蛋白和GST—MIC2C W/A突變體蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，

10、GST—MIC6C蛋白和GST—MIC6CW/V突變體蛋白為探針蛋白分別與速殖子裂解液進(jìn)行GST沉降實(shí)驗(yàn)，SDS—PAGE分析。 制備弓形蟲(chóng)速殖子涂片，常規(guī)固定、封閉；用兔源性GST—MIC6C多克隆抗體和鼠源性aldolase—His多克隆抗體作為一抗，先用羊抗兔IgG—TRITC熒光二抗進(jìn)行溫育，再用兔抗大鼠IgG—FITC熒光二抗溫育，熒光顯微鏡下觀察并拍照，圖像分析軟件分析。一抗采為兔源性GST—MIC2C多克隆抗體和鼠

11、源性aldolase—His多克隆抗體，相同方法對(duì)MIC2和Aldolase進(jìn)行間接免疫熒光定位。 研究結(jié)果： 1、GST—MIC6C蛋白及其多克隆抗體的制備 成功構(gòu)建了MIC6C/pGEX—4T-1重組質(zhì)粒，并誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白；親和層析法純化融合蛋白GST—MIC6C，核酸蛋白儀分析其濃度為3.23mg/ml。用GST—MIC6C蛋白分別皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔和SD大鼠，收集抗血清，親和層析法純化抗體，棋盤(pán)

12、滴定法測(cè)定兔源性GST—MIC6C多克隆抗體的效價(jià)為1:8000，大鼠源性GST—MIC6C多克隆抗體的效價(jià)為1:4000。 2、篩選并鑒定與MIC6C作用的蛋白 GST—MIC6C與弓形蟲(chóng)速殖子裂解液進(jìn)行GST沉降實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物中有蛋白條帶，而以GST為對(duì)照蛋白的GST沉降實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物中沒(méi)有相應(yīng)的蛋白條帶。蛋白N端測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST2在線相似搜索，與醛縮酶(aldolase)蛋白的N端序列完全一致。成功構(gòu)建了Aldolase

13、/pET30a和Actin/pET30a原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得了純化的重組蛋白。Aldolase—His蛋白濃度為7.28mg/ml；Actin—His蛋白濃度為0.35mg/ml。重組蛋白的多克隆抗體效價(jià)為1:4000。用大鼠源性Aldolase—His多克隆抗體和Actin—His多克隆抗體作為一抗，兔抗大鼠IgG—HRP為二抗，Western blot分析GST沉降初篩產(chǎn)物，X—感光膠片顯示GST—MIC6C與弓形蟲(chóng)速

14、殖子裂解液GST沉降產(chǎn)物中有蛋白條帶可分別被上述一抗識(shí)別。 GST—MIC6C多克隆抗體包被的protein G sepharose與弓形蟲(chóng)裂解液的免疫共沉淀產(chǎn)物中有蛋白條帶可分別被GST—MIC6C抗體、Aldolase—His抗體和Actin—His抗體識(shí)別，而在免疫前血清的免疫共沉淀產(chǎn)物中卻沒(méi)有可以識(shí)別的蛋白條帶。 以GST—aldolase為探針蛋白與Actin—His蛋白液的GST沉降產(chǎn)物中有蛋白條帶，且大小

15、與Actin—His相符，而GST對(duì)照蛋白的GST沉降產(chǎn)物中則沒(méi)有蛋白條帶。 3、MIC6C與Aldolase的作用位點(diǎn)及其在蟲(chóng)體內(nèi)的定位 獲得了GST—MIC6CW/V突變體蛋白，蛋白濃度為1.78mg/ml。GST—MIC6CW/V蛋白與速殖子裂解液的GST沉降產(chǎn)物中沒(méi)有蛋白條帶。Western blot顯示在GST—MIC6C的GST沉降產(chǎn)物中有蛋白條帶可分別被特異的一抗所識(shí)別，而GST—MIC6CW/V蛋白的產(chǎn)物

16、中則沒(méi)有。制備了GST—MIC2C、GST—MIC2CW/A蛋白和GST—MIC2C多克隆抗體，蛋白濃度分別為3.07mg/ml和2.55mg/ml?？贵w的效價(jià)為1:8000。GST—MIC6C和GST—MIC2C蛋白分別與速殖子裂解液的GST沉降產(chǎn)物中可見(jiàn)蛋白條帶，而GST—MIC6CW/V和GST—MIC2CW/A突變體蛋白的GST沉降產(chǎn)物中則沒(méi)有目的條帶。 間接免疫熒光定位顯示：MIC6(紅色熒光)和Aldolase(綠色