弓形蟲棒狀體蛋白38的序列變異及免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、弓形蟲自從1908年被發(fā)現(xiàn)以來，人們對弓形蟲和弓形蟲病的認(rèn)識經(jīng)歷了一個多世紀(jì)的發(fā)展變遷。現(xiàn)為人們熟知的是弓形蟲病可以通過母嬰傳播，經(jīng)口傳播，血液傳播等。因其宿主的廣泛性（幾乎所有的溫血動物）和傳播途徑的多樣化，全球有三分之一的人感染弓形蟲病，且每年呈增長趨勢。雖然大多數(shù)免疫功能正常的人為隱形感染，但是到目前為止，仍然沒有藥物可以根治弓形蟲病。臨床上治療弓形蟲病主要依賴一些磺胺類的化學(xué)藥物，而這些化學(xué)藥物只針對弓形蟲速殖子發(fā)揮作用，對弓形

2、蟲慢性感染沒有很好的療效。因此，抗弓形蟲病疫苗的研究已成為弓形蟲病研究的熱點(diǎn)問題。弓形蟲疫苗的研究經(jīng)歷了一個漫長的過程，從全蟲疫苗到蟲體特異組分疫苗階段，到基因工程疫苗再到現(xiàn)在的DNA疫苗階段。DNA疫苗的候選抗原分子多為與弓形蟲毒力、入侵相關(guān)的一些因子，包括微線體、棒狀體和致密顆粒等弓形蟲亞細(xì)胞器分泌的抗原分子。弓形蟲棒狀體蛋白38（rhoptry protein38，TgROP38）可以調(diào)節(jié)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在不同基因型的弓形蟲

3、蟲株中的表達(dá)量差異很大，而且在弓形蟲由速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)換過程中，大多數(shù)棒狀體蛋白的表達(dá)量下調(diào)，而ROP38的表達(dá)量反而上調(diào)了5倍。本論文對弓形蟲ROP38基因的序列變異、蛋白特性和疫苗免疫保護(hù)作用進(jìn)行了研究。
　　本論文首先對不同宿主和地理來源的13個弓形蟲蟲株的ROP38基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增、克隆和測序。13個蟲株ROP38片段長度為2646bp-2650bp，種內(nèi)變異率為0.2-1.1％。用貝葉斯（Bayesi

4、an inference，BI）進(jìn)行的種系發(fā)育分析顯示，基于ROP38基因重構(gòu)的種系發(fā)育樹結(jié)果不能較好地顯示弓形蟲不同基因型蟲株之間的遺傳變異關(guān)系。
　　其次應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，預(yù)測了ROP38蛋白的生物學(xué)特性。以弓形蟲RH株基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR擴(kuò)增出TgROP38基因的ORF序列。測序后，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明TgROP38蛋白是跨膜蛋白，含有多個親水區(qū)域和B細(xì)胞抗原表位。<

5、br>　　本研究還評價了ROP38核酸疫苗的免疫保護(hù)作用。首先構(gòu)建pVAX-ROP38真核表達(dá)質(zhì)粒，成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)于真核細(xì)胞HEK293。經(jīng)DNA免疫昆明系小白鼠，同時設(shè)立pVAX I、PBS和空白三個對照組。經(jīng)過3次免疫后，測定相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)。于三免后第14d，分別用弓形蟲強(qiáng)毒RH株速殖子致死劑量（1000個速殖子）腹腔感染小鼠，用弓形蟲弱毒Prugniaud（PRU）蟲株10個包囊灌胃感染小鼠，觀察其存活時間和包囊減少

6、率。結(jié)果顯示，構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒 pVAX-ROP38免疫昆明小鼠后，可產(chǎn)生高水平IgG抗體水平和IL-2和IFN-γ，有效地誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8- T淋巴細(xì)胞。RH株攻擊感染實(shí)驗(yàn)顯示，與7d內(nèi)死亡的三個對照組相比，免疫組不能顯著延長小鼠存活時間（pVAX-ROP38，8.1d±0.75）。但與三個對照組相比，經(jīng)pVAX-ROP38免疫后，小鼠的腦包囊減少率為76.6%，差異

7、明顯。
　　本研究最后評價了rROP38和rROP18混合蛋白疫苗的免疫保護(hù)作用以及聚D,L-乳酸-co-乙醇酸（PLG）緩釋顆粒的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。構(gòu)建了PLG-rROP38和PLG-rROP18的緩釋顆粒。用rROP38、PLG-rROP38、rROP18、PLG-rROP18、rROP38-rROP18和PLG-rROP38- rROP18免疫昆明小鼠，同時設(shè)立PBS、PLG-PBS和空白對照3個對照組。蛋白疫苗免疫后，測定小鼠

8、體內(nèi)相應(yīng)的體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)，并于二免后6w，用PRU蟲株10個包囊灌胃感染小鼠，觀察其包囊減少率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rROP38和rROP18緩釋顆粒的蛋白疫苗免疫昆明小鼠后，可產(chǎn)生高水平抗體及抗體亞類水平、IFN-γ和 IL-2含量，可有效地誘導(dǎo) Th1-Th2混合型細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8- T淋巴細(xì)胞增殖。與對照組相比，rROP38和rROP18緩釋顆?；旌弦呙缃M的包囊減少率高達(dá)