弓形蟲表面抗原蛋白5的結(jié)構(gòu)分析及免疫學(xué)研究.pdf

1、弓形蟲是一種機會性胞內(nèi)寄生蟲，它能夠感染幾乎所有的溫血動物包括野生哺乳動物、鳥類、家畜和人類。由弓形蟲感染而引起的弓形蟲病遍布全球各個角落，弓形蟲病是人獸共患病，嚴重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。目前尚無針對弓形蟲病的特效藥物，因此對弓形蟲病的防治工作迫在眉睫。本實驗利用相應(yīng)軟件和在線數(shù)據(jù)庫分析了弓形蟲表面抗原蛋白5(Surface AntigenGlycoprotein5，SAG5)的理化特點、同源性、二維結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)、B細胞抗原表位

2、和T細胞抗原表位。構(gòu)建SAG5A和SAG5D的DNA重組疫苗來免疫小鼠，并利用抗原多肽和α半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)增強疫苗的免疫反應(yīng)，通過動物實驗驗證疫苗的可靠性。本研究工作填補了弓形蟲表面抗原蛋白SAG5的認知空白，為弓形蟲病有效疫苗的研制提供了參考。
　　目的:研究弓形蟲表面抗原蛋白SAG5的基本理化性質(zhì)、二維結(jié)構(gòu)和三維空間結(jié)構(gòu)。分析弓形蟲表面抗原蛋白SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的B細胞抗原表位和T

3、細胞抗原表位。構(gòu)建SAG5A基因的重組DNA載體并與多肽(HAPTPSFLGLLAVVF)一同免疫小鼠，通過對小鼠腦部包囊計數(shù)來評價SAG5A基因與多肽的免疫保護性。構(gòu)建SAG5D基因表達載體并與α-GalCer一同免疫小鼠，通過弓形蟲速殖子和包囊攻擊實驗來評價SAG5D基因和α-GalCer一起對小鼠的免疫保護性。
　　方法:利用在線分析軟件預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)域和信號肽序列。運用

4、在線程序PSORTⅡ分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的亞細胞定位。利用在線程序NetNGlyc1.0分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的N-糖基化位點。運用在線程序CSS-Palm和NetPhos2.0分析SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的磷酸化位點和?；稽c。利用DNASTAR、Gene Runner和DNAMAN等軟件預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的B細胞抗原表位

5、。利用在線分析軟件IEDB預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的T細胞抗原表位。利用在線工具T-Coffee對這四種蛋白的序列進行比對，運用在線分析軟件SWISS-MODEL和軟件VMD預(yù)測SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的二維和三維結(jié)構(gòu)。利用引物設(shè)計軟件設(shè)計出SAG5A和SAG5D的上下游引物，PCR反應(yīng)得到SAG5A和SAG5D的目的基因，經(jīng)過雙酶切將目的基因和pEGFP-C1載體連接在一起構(gòu)建SAG5A

6、和SAG5D的真核表達載體。構(gòu)建好的載體通過測序來檢驗SAG5A和SAG5D基因的完整性。利用試劑盒大量提取構(gòu)建的SAG5A和SAG5D真核表達質(zhì)粒來免疫BALB/c小鼠。在SAG5D基因疫苗免疫小鼠過程中通過加入佐劑α半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)來提高免疫效應(yīng)。構(gòu)建的SAG5A基因疫苗引入抗原多肽并通過免疫策略來提高免疫效果。在基因疫苗免疫后對小鼠取血并收集血清，通過檢測小鼠血清中抗弓形蟲總IgG、IgG1、IgG2a及脾細胞內(nèi)

7、細胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的含量來評價疫苗刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。對SAG5D和α-GalCer免疫的小鼠通過弓形蟲速殖子(RH株)和包囊(PRU株)攻擊實驗來驗證疫苗的保護性。對SAG5A和抗原多肽免疫的動物用包囊(PRU株)攻擊來驗證免疫策略的作用及基因疫苗的保護性。
　　結(jié)果:利用軟件和在線工具分析了SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D四種蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG

8、5D擁有相似的物理化學(xué)參數(shù)，其中SAG5A和SAG5D有相近的理化參數(shù)，SAG5B和SAG5C有著更為相近的理化性質(zhì)。運用在線程序PSORTⅡ分析這四種蛋白的亞細胞定位，結(jié)果顯示SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D均分布在質(zhì)膜上的概率最大。對這些蛋白翻譯后修飾的預(yù)測發(fā)現(xiàn)它們有相似的糖基化位點、磷酸化位點和?；稽c，其中SAG5B和SAG5C的修飾位點基本一致。利用DNASTAR軟件和IEDB數(shù)據(jù)庫分析了SAG5A、SAG5B

9、、SAG5C和SAG5D蛋白的B細胞抗原表位，結(jié)果顯示SAG5B和SAG5C具有相近的B細胞抗原表位，利用在線IEDB數(shù)據(jù)庫分析它們的T細胞抗原表位，并篩選出一些優(yōu)秀的親水性強、可塑性大和抗原指數(shù)高的抗原表位區(qū)域，結(jié)果表明這四種蛋白均是良好的表位抗原，此外我們還用這些軟件和數(shù)據(jù)庫分析了SAG1蛋白的B細胞和T細胞表位抗原，并將這四種蛋白的表位抗原與SAG1比較，結(jié)果顯示SAG5A和SAG5D有更優(yōu)秀的抗原表位，SAG5B和SAG5C的抗

10、原表位與 SAG1相近。經(jīng)過T-Coffee軟件的序列比對，SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D具有很高的同源性，而SAG5B和SAG5C的相似度更是達到了96％。通過DNASTAR和VMD軟件分析，SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D蛋白具有相近的β折疊和α螺旋區(qū)域，而SAG5B和SAG5C有著幾乎一樣的β折疊和α螺旋分布。經(jīng)過VMD軟件分析，這些蛋白有著相似的三維空間結(jié)構(gòu)，而SAG5B和SAG5C的空間結(jié)構(gòu)幾乎完

11、全一樣。
　　利用引物設(shè)計軟件成功設(shè)計出SAG5A和SAG5D的上下游引物，以弓形蟲cDNA為模板，利用PCR反應(yīng)得到產(chǎn)物，經(jīng)過凝膠電泳分析得到大小均為1，089 bp的SAG5A和SAG5D基因片段，利用膠回收試劑盒回收并純化大量目的基因SAG5A和SAG5D。將目的基因和pEGFP-C1真核表達載體雙酶切，在DNA連接酶的幫助下，將目的基因和載體連接在一起。重組后載體轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細胞，菌液涂板后每個培養(yǎng)皿中得到5-10個

12、獨立菌株，將菌株挑到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒將菌體中質(zhì)粒提取出來，雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳實驗顯示在4，700bp和1，089bp處有明亮條帶，這證明我們成功構(gòu)建了pEGFP-C1-SAG5A(pSAG5A)和pEGFP-C1-SAG5D(pSAG5D)的真核表達載體。將菌體大量培養(yǎng)，利用無內(nèi)毒素大提試劑盒大量提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，檢測提取質(zhì)粒的濃度均在1，000μg/ml以上，達到后續(xù)試驗要求。為驗證構(gòu)建載體在細胞內(nèi)正常表達，將

13、無內(nèi)毒素載體轉(zhuǎn)染至HEK293-T細胞，利用熒光顯微鏡觀察pSAG5A和pSAG5D轉(zhuǎn)染的細胞，兩組細胞均能被激發(fā)出綠色熒光，這說明重組載體可在細胞中正常表達蛋白。將轉(zhuǎn)染的細胞大量收集并裂解提取細胞全蛋白，并對提取的蛋白進行Western blot實驗檢測，結(jié)果在60 kD處有特異性條帶出現(xiàn)，進一步證明了重組載體中SAG5A和SAG5D基因能夠成功表達成蛋白。
　　pSAG5A載體和篩選的多肽依據(jù)制定的策略先后免疫BALB/c小鼠

14、，pSAG5D真核表達載體和α-GalCer一同免疫小鼠，每次免疫2周后對對照組（PBS和pEGFP-C1組）和免疫組（α-GalCer、pSAG5、pSAG5、pSAG5D/α-GalCer和pSAG5A/多肽組）小鼠進行取血，吸取血清并檢測其中抗弓形蟲總IgG、IgG1、IgG2a抗體的濃度。pSAG5A和多肽免疫的小鼠血清中IgG和IgG2a抗體的水平顯著高于對照組和其它實驗組(P＜0.05);pSAG5A免疫組和多肽免疫組中Ig

15、G和IgG2a抗體的水平明顯高于空白對照組(P＜0.05)，pSAG5A免疫組和多肽免疫組之間沒有顯著性差別(P＞0.05);實驗組和對照組小鼠的IgG1抗體濃度沒有顯著性差異(P＞0.05)。pSAG5D和α-GalCer一同免疫的小鼠血清中IgG和IgG2a抗體的水平明顯高于其它組(P＜0.05);pSAG5D免疫組和α-GalCer免疫組中IgG和IgG2a抗體的水平顯著高于空白對照組(P＜0.05)，而pSAG5D免疫組和α-G

16、alCer免疫組之間沒有顯著性差別（P＞0.05）;各組小鼠的IgG1抗體濃度沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　為進一步證明小鼠的免疫反應(yīng)，小鼠脾細胞中細胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ的水平被檢測。pSAG5A和多肽共同免疫組中IFN-γ的水平（721.0±99.6）顯著高于其它實驗組和對照組(P＜0.05);pSAG5A（505.3±71.6）和多肽（489.7±98.9）兩個實驗組中的IFN-γ水平顯著高于空載體組

17、（52.4±11.6）和PBS組（55.5±11.7）（P＜0.05），但兩者之間沒有顯著性差異（P＞0.05）;而細胞因子IL-4和IL-10的水平在各組間沒有顯著性差別(P＞0.05)。pSAG5D和α-GalCer一起免疫小鼠脾細胞的IFN-γ水平（781.36±57.57）顯著高于其它組(P＜0.05);pSAG5D組（573.43±60.2）和α-GalCer組（343.6±50.88）中的IFN-γ水平明顯高于pEGFP-C

18、1組（53.15±8.71）和PBS組（52.07±8.23）(P＜0.05);pSAG5D和α-GalCer共同免疫組（76.73±6.08）及α-GalCer免疫組（75.46±5.7）中小鼠脾細胞中IL-4的水平顯著高于pSAG5D組（36.65±3.52）、pEGFP-C1組（39.24±6.43）和PBS組（36.36±5.25）(P＜0.05);而所有小鼠的IL-10的水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05)。
　　最后通過

19、弓形蟲攻擊實驗來評價基因疫苗的免疫保護性。用弱毒株(PRU)弓形蟲包囊攻擊SAG5A所有組的小鼠，結(jié)果顯示pSAG5A和多肽共同免疫小鼠腦內(nèi)的包囊數(shù)量（436±174）明顯少于其它組（P＜0.05）;pSAG5A組（815±197）和多肽組（732±160）小鼠腦內(nèi)包囊顯著性少于pEGFP-C1組（1350±268）和PBS組（1260±241）(P＜0.05)，而pSAG5A組和多肽組之間沒有顯著性差別。另一實驗中，用強毒株(RH)弓

20、形蟲速殖子和弱毒株(PRU)包囊攻擊SAG5D所有組的小鼠，結(jié)果顯示pSAG5D和α-GalCer一起免疫小鼠的生存期能達到17天，而pSAG5D組、α-GalCer、pEGFP-C1和PBS組的生存時間分別為13天、10天、7天和6天。同時pSAG5D和α-GalCer免疫小鼠腦內(nèi)包囊數(shù)量最少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:生物信息學(xué)分析表明SAG5A、SAG5B、SAG5C和SAG5D的同源性很高，這四種蛋白都具有優(yōu)秀的B細胞抗