弓形蟲速殖子DNA提取及LAMP檢測弓形蟲的初步研究.pdf

1、目的:(1)探討弓形蟲速殖子體外培養(yǎng)、凍存和純化的方法,為后續(xù)開展弓形蟲的相關(guān)研究提供豐富而純化的速殖子。(2)比較5種常用弓形蟲速殖子DNA提取方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)弓形蟲速殖子DNA.提取篩選高效簡便的方法。(3)建立和優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系,為弓形蟲病的診斷建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單快速的弓形蟲DNA檢測方法。
　　 方法:(1)將弓形蟲速殖子接種至Hela細(xì)胞,動(dòng)態(tài)觀察速殖子在Hela細(xì)胞中增殖的體外培養(yǎng)過程。(2)速殖子

2、中加入7％二甲亞砜和15％的乙二醇于-76℃凍存,觀察6個(gè)月內(nèi)兩種防凍劑對(duì)速殖子的凍存保護(hù)效果。(3)比較3、5、8μm3種規(guī)格的濾膜對(duì)體內(nèi)外培養(yǎng)的速殖子的純化效果。(4)分別以試劑盒法、直接裂解法、煮沸法、酚.氯仿法和鹽析法提取10倍系列稀釋的弓形蟲速殖子DNA,通過分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳和PCR比較其效果。(5)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立了檢測弓形蟲DNA的方法,并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性、敏感性評(píng)估,并與傳統(tǒng)

3、PCR進(jìn)行了比較。
　　 結(jié)果:(1)弓形蟲速殖子能在Hela細(xì)胞中較好的生長增殖,并且在96～144h增殖達(dá)到高峰,這個(gè)時(shí)間段收集速殖子產(chǎn)量較高,Hela細(xì)胞基本被破壞,含Hela細(xì)胞較少。(2)用7％二甲亞砜和15％的乙二醇-76℃凍存速殖子,第1個(gè)月末兩者防凍效果沒有明顯差異(P>0.05),第3個(gè)月末和第6個(gè)月末7％二甲亞砜的防凍效果優(yōu)于15％的乙二醇(P<0.05)。隨著時(shí)間的推移速殖子的存活率下降,但在6個(gè)月末兩種方

4、法凍存的速殖子都能成功感染小鼠。(3)在體內(nèi)培養(yǎng)的速殖子純化時(shí),3、5、8μm3種規(guī)格的濾膜對(duì)白細(xì)胞的清除率無差別(P>0.05);對(duì)紅細(xì)胞的清除率隨濾膜孔徑的增加而降低,三者之間具有顯著差異(P<0.05)；速殖子的回收率隨孔徑的增加而增加,三者間具有顯著差異(P<0.05)。在體外培養(yǎng)的速殖子純化時(shí),3、5、8μm3種規(guī)格的濾膜對(duì)Hela細(xì)胞的清除率無差別(P>0.05),速殖子的回收率隨孔徑的增加而增加,三者間具有顯著差異(P<0

5、.05)。(4)酚-氯仿法提取的DNA純度最高,煮沸法、鹽析法、直接裂解法和試劑盒法依次降低；瓊脂糖凝膠電泳可檢測出由直接裂解法、酚-氯仿法、鹽析法提取1×106個(gè)速殖子的基因組DNA；試劑盒法、直接裂解法、煮沸法、酚.氯仿法、鹽析法提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增可檢測最少速殖子的數(shù)量依次為1×104,無目的條帶,1×102,1×101,1×103個(gè)。(5)通過對(duì)建立的LAMP擴(kuò)增弓形蟲DNA反應(yīng)體系的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)25μl體系以1.2 mMdN

6、TPs,6mM MgSO4,8U Bst DNA聚合酶為佳,反應(yīng)溫度在63℃為佳,反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)需要選擇30～60min之間,用瓊脂糖凝膠電泳檢測未能發(fā)現(xiàn)加入環(huán)引物能加快反應(yīng)溫度。甜菜堿對(duì)反應(yīng)影響不大。特異性評(píng)估表明僅弓形蟲檢測陽性。LAMP的靈敏度比常規(guī)PCR高10倍,即每毫升可檢測到個(gè)位數(shù)的速殖子數(shù)。在檢測弓形蟲感染小鼠組織標(biāo)本時(shí),兩者特異性無差別。除瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)果外,還可以通過比濁儀,離心后肉眼觀察沉淀及加入熒光染料后

7、在紫外燈下觀察LAMP結(jié)果。
　　 結(jié)論:Hela細(xì)胞可用于弓形蟲速殖子的體外培養(yǎng)增殖,速殖子在加入防凍劑的情況下可在-76℃冰箱保存半年以上,可以根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇不同孔徑的濾膜用于弓形蟲速殖子的純化。經(jīng)典的酚-氯仿法體取速殖子DNA純度高,但操作比較繁瑣,直接煮沸法操作方便,能滿足一般實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA的提取要求。本研究建立的LAMP檢測弓形蟲基因組DNA方法,特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便快速且成本低,通過不斷的改進(jìn),有望成為一種新的診