弓形蟲抑制含蟲空泡與溶酶體融合機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:以弓形蟲PRU-T2株感染巨噬細(xì)胞建立體外感染模型,免疫熒光技術(shù)檢測含蟲空泡膜上介導(dǎo)其與溶酶體融合的三種蛋白(Rab5、Rab7、EEA-1)的動態(tài)變化。研究弓形蟲抑制含蟲空泡與溶酶體融合的機(jī)制,為闡明弓形蟲免疫逃逸的機(jī)制及合理設(shè)計(jì)其疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、建立體外弓形蟲感染細(xì)胞模型分別培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、小鼠肺泡巨噬細(xì)胞、RAW264.7鼠傳代巨噬細(xì)胞,用PRU-T2弓形蟲感染細(xì)胞

2、(以滅活的PRU-T2弓形蟲為陰性對照),分別于30 min、60 min、90 min及120 min取出蓋玻片,固定,瑞氏染色。比較弓形蟲入侵以上4種細(xì)胞形成含蟲空泡的時間與數(shù)量。選擇合適的細(xì)胞用于下一步研究。
　　2、間接免疫熒光技術(shù)分別檢測Rab5、Rab7、EEA-1在含蟲空泡膜上的動態(tài)分布取對數(shù)生長期細(xì)胞消化吹散;將細(xì)胞鋪于預(yù)置有蓋玻片的24孔板中,待細(xì)胞爬片后將弓形蟲加入到孔中感染巨噬細(xì)胞;取出蓋玻片,用4％多聚甲醛

3、固定10-30min;用0.5%Triton-100處理10-20min;加入2%胎牛白蛋白,37℃溫箱中孵育1h封閉;加入適當(dāng)稀釋比的一抗工作液,4℃過夜;洗滌,加二抗,37℃溫箱中孵育1h;洗滌,晾干,攝像。
　　結(jié)果:
　　1、比較了PRU-T2弓形蟲感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、小鼠肺泡腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞后對細(xì)胞狀態(tài)的影響及含蟲空泡形成的時間與數(shù)量。從接種鼠腹腔取出4℃放置1-2天的蟲體,分別

4、感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、小鼠肺泡腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞,于30min計(jì)數(shù)50個細(xì)胞中含蟲泡的數(shù)量分別是50、10-50、50-80、50-100。
　　2、Rab5在含蟲空泡膜上持續(xù)存在,在熱滅活弓形蟲吞噬體上隨著時間的推移,含量下降直至消失;在含蟲空泡膜上檢測不到Rab7,在熱滅活弓形蟲吞噬體膜上Rab7含量升高; EEA1(早內(nèi)體自身抗原1)在含蟲空泡膜上無,在熱滅活弓形蟲吞噬體膜上存在。