弓形蟲(chóng)SAG2基因的克隆、表達(dá)及其初步鑒定.pdf

1、弓形蟲(chóng)病是由剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)引起的一種重要人獸共患寄生蟲(chóng)病。當(dāng)孕婦感染弓形蟲(chóng)后，容易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒畸形等。因此孕婦弓形蟲(chóng)感染的產(chǎn)前診斷，在優(yōu)生學(xué)上意義重大。
　　 弓形蟲(chóng)病診斷方法大致可分為病原學(xué)檢查、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)三大類。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且其特異性和敏感性不高，不能適應(yīng)當(dāng)前弓形蟲(chóng)病珍斷及防治的需要；分子生物學(xué)診斷技術(shù)雖然具有較高的敏感性，但由于其操作復(fù)雜或?qū)嶒?yàn)條

2、件要求較高，難以推廣應(yīng)用；免疫學(xué)診斷方法是弓形蟲(chóng)感染的實(shí)驗(yàn)珍斷的常規(guī)方法，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，所以，免疫學(xué)方法仍是目前弓形蟲(chóng)感染的主要診斷手段。由于目前常用全蟲(chóng)抗原作血清學(xué)檢測(cè)，其結(jié)果有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，給診斷帶來(lái)許多不便。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，研制出重組抗原，以取代全蟲(chóng)抗原，大大提高弓形蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)室診斷的精確度和敏感度。
　　 本文根據(jù)GenBank中已公布的弓形蟲(chóng)SAG2的基因序列用軟件自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，

3、用此引物對(duì)目的基因片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用PCR純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用質(zhì)粒提取試劑盒在大腸桿菌的DH5α中提取PGEX-4T-1質(zhì)粒。然后對(duì)純化的PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，利用瓊脂糖凝膠回收PCR酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。用大連寶生的連接試劑對(duì)PCR和pGEX-4T-1的回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建pGEX-4T-1/SAG2重組質(zhì)粒。用PCR結(jié)合雙酶切的方法鑒定，核酸測(cè)序驗(yàn)

4、證。將pGEX-4T-1/SAG2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)，然后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)驗(yàn)證后，將重組菌表達(dá)產(chǎn)物溶于尿素中，通過(guò)精氨酸氧化/還原型谷胱苷肽系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性后的蛋白再進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮后的蛋白溶液過(guò)GST親和層析柱。并用酶標(biāo)技術(shù)(ELISA間接法)和金標(biāo)技術(shù)(捕獲法、雙抗原夾心法)對(duì)純化的GST-SAG2融合蛋白的抗原性進(jìn)行鑒定，最終獲得保留