弓形蟲SAG2基因的克隆、表達及其初步鑒定.pdf

1、弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)引起的一種重要人獸共患寄生蟲病。當孕婦感染弓形蟲后，容易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒畸形等。因此孕婦弓形蟲感染的產(chǎn)前診斷，在優(yōu)生學(xué)上意義重大。
　　 弓形蟲病診斷方法大致可分為病原學(xué)檢查、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)三大類。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢查方法費時、費力，且其特異性和敏感性不高，不能適應(yīng)當前弓形蟲病珍斷及防治的需要；分子生物學(xué)診斷技術(shù)雖然具有較高的敏感性，但由于其操作復(fù)雜或?qū)嶒灄l

2、件要求較高，難以推廣應(yīng)用；免疫學(xué)診斷方法是弓形蟲感染的實驗珍斷的常規(guī)方法，具有敏感性高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，所以，免疫學(xué)方法仍是目前弓形蟲感染的主要診斷手段。由于目前常用全蟲抗原作血清學(xué)檢測，其結(jié)果有時會出現(xiàn)假陽性，給診斷帶來許多不便。本實驗利用基因重組技術(shù)，研制出重組抗原，以取代全蟲抗原，大大提高弓形蟲感染實驗室診斷的精確度和敏感度。
　　 本文根據(jù)GenBank中已公布的弓形蟲SAG2的基因序列用軟件自行設(shè)計一對引物，

3、用此引物對目的基因片段進行RT-PCR擴增，用PCR純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。利用質(zhì)粒提取試劑盒在大腸桿菌的DH5α中提取PGEX-4T-1質(zhì)粒。然后對純化的PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，利用瓊脂糖凝膠回收PCR酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。用大連寶生的連接試劑對PCR和pGEX-4T-1的回收產(chǎn)物進行連接，構(gòu)建pGEX-4T-1/SAG2重組質(zhì)粒。用PCR結(jié)合雙酶切的方法鑒定，核酸測序驗

4、證。將pGEX-4T-1/SAG2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)，然后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測驗證后，將重組菌表達產(chǎn)物溶于尿素中，通過精氨酸氧化/還原型谷胱苷肽系統(tǒng)進行復(fù)性。復(fù)性后的蛋白再進行超濾濃縮，將濃縮后的蛋白溶液過GST親和層析柱。并用酶標技術(shù)(ELISA間接法)和金標技術(shù)(捕獲法、雙抗原夾心法)對純化的GST-SAG2融合蛋白的抗原性進行鑒定，最終獲得保留