弓形蟲SAG1、GRA2單基因疫苗及SAG1-GRA2復(fù)合基因疫苗的免疫效果研究.pdf

1、弓形蟲是一種呈世界性分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染包括人類在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物，引起人獸共患寄生蟲病。孕婦感染弓形蟲可導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)，存活者也常患有畸形、智力障礙等嚴(yán)重后遺癥。在艾滋病、惡性腫瘤、器官移植等免疫力功能低下者，感染弓形蟲是致死性病因之一。為了人類的健康和優(yōu)生優(yōu)育，研制安全有效的弓形蟲疫苗，無疑是防治弓形蟲病的重要措施。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，弓形蟲疫苗從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得

2、了很大進(jìn)展。雖然弓形蟲是單細(xì)胞生物，但其生活史的復(fù)雜性，形態(tài)的多樣性，入侵宿主的廣泛性，造成其不同性質(zhì)抗原的免疫性以及致病分子的機(jī)制均不相同，因此在研究有關(guān)弓形蟲疫苗的過程中，發(fā)展多種抗原組合、針對(duì)不同生活史發(fā)育階段的復(fù)合多價(jià)疫苗和核酸疫苗是研究弓形蟲疫苗過程中的一個(gè)發(fā)展方向與共識(shí)瞳。 SAGl(p30)作為弓形蟲速殖子期特異的主要表面抗原之一，含量約占蟲體總蛋白的3﹪～5﹪，主要存在于弓形蟲表膜及內(nèi)膜系統(tǒng)，也可分泌到蟲體外環(huán)境

3、，具有高度的免疫原性和免疫保護(hù)性，是弓形蟲感染免疫診斷和疫苗開發(fā)的主要候選抗原。 致密顆粒蛋白(dense granuleprotein，GRA)是弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后由致密顆粒釋放入納蟲泡(parasitophorolJs’VgCIJble，PV)的一類分泌代謝抗原，目前已知至少有十種畸。由于該類蛋白在人體和實(shí)驗(yàn)中具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和免疫原性，因而在弓形蟲病診斷及免疫預(yù)防的研究中備受關(guān)注。GRA2的抗原性很強(qiáng)，研究表明其在急

4、慢性弓形蟲感染者血清中普遍存在。至少存在三個(gè)B細(xì)胞表位和一個(gè)T細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgM、IgA、IgG多種抗體，激活GRA2特異的CD<,4><'+>T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫。因此GRA2作為弓形蟲病的診斷抗原及可能的疫苗成分頗具有研究?jī)r(jià)值。國(guó)外研究資料表明：SAG1和GRA2在弓形蟲特異性T輔助淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)期免疫機(jī)制中起重要作用，他們?cè)诠蜗x中宿主寄生史中持續(xù)表達(dá)，從慢性感染弓形蟲患者的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)SAG1和GRA2的特異性CD

5、<,4><'+>T細(xì)胞克隆，證明SAG1-GRA2復(fù)合基因是人類弓形蟲疫苗的重要候選基因。 本研究根據(jù)已發(fā)表的弓形蟲SAG1和GRA2基因序列，自行設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增得到SAG1和GRA2基因，并體外連接于pcDNA3．1質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SAGl和pcDNA3.1-GRA2，與復(fù)合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-SAG1-GRA2分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞(HFF)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用Trizol提取

6、細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為引物逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一條鏈；對(duì)管家基因β-actin進(jìn)行PCR驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄；然后分別對(duì)SAG1、GRA2及SAG1-GRA2基因片段進(jìn)行PCR，證實(shí)真核表達(dá)載體pcDNA3.1能夠攜帶弓形蟲抗原基因SAG1、GRA2及SAG1-GRA2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此后，用堿裂解法大量制備質(zhì)粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2及pcDNA3.1-SAG1-GRA2，以肌注方式接種