弓形蟲主要抗原SAG1（P30）基因的克隆，表達及生物活性研究.pdf

1、弓形蟲SAG1基因所編碼的蛋白為弓形蟲主要表面抗原P30，其約占速殖子總蛋白量的5％，P30對侵入宿主細胞及其毒力具有重要性，并具有高度免疫原性和免疫保護性，因而成為弓形蟲病疫苗和檢測的研究重點。 通過制備并分析弓形蟲抗原蛋白，以此抗原制備高效價的兔抗弓形蟲多克隆抗體，為弓形蟲的免疫檢測和診斷提供有效的方法和途徑，同時也為基因工程產(chǎn)物的鑒定提供方便有效的檢測手段。速殖子主要來源于感染后72—74 h獲得的腹水，通過常規(guī)方法制備和

2、提純弓形蟲可溶性抗原，以抗原和福氏佐劑制備成完全和不完全福氏佐劑通過脊柱兩旁皮下多點免疫的途徑免疫新西蘭大白兔，制備兔抗弓形體多克隆抗體，間接ELISA法檢測血清中抗體的效價。結(jié)果兔抗弓形體抗體效價在60，000以上。 根據(jù)已知的SAG1基因序列，設(shè)計引物，以弓形蟲速殖子總DNA為模板，PCR擴增出p30基因，再將片段構(gòu)建到原核表達載體pGEX—6P—1中，經(jīng)抗性篩選，以及PCR、雙酶切鑒定，挑選出陽性克隆子進行測序，結(jié)果表明成

3、功構(gòu)建了原核表達重組載體pGEX—P30。將重組載體pGEX—P30轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）中，用異丙基—β—D—半乳糖（IPTG）誘導(dǎo)表達目的蛋白。SDS—PAGE分析表達的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)期目的蛋白大小約為54 KD處有特異的條帶，用凝膠成像軟件分析其表達量為54．0％。Western—blotting結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細菌產(chǎn)生的可溶與包涵體形式表達的的融合蛋白均可與抗弓形蟲的多克隆抗體特異結(jié)合。 將純化后的

4、P30抗原與佐劑混合乳化后，注射免疫小鼠，經(jīng)過27天，用間接酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）的方法測得抗體效價超過1：12800。再用弓形蟲滋養(yǎng)體感染免疫過的和對照的小鼠，結(jié)果顯示免疫過的小鼠存活時間明顯比對照組長，說明P30抗原能激發(fā)小鼠體液免疫，對弓形體感染具有一定的保護性。之后，為了證明純化后的P30能否用來做檢測試劑的可行性，我們用P30包被酶標(biāo)版，用ELISA的方法檢測感染組、免疫陽性對照組和陰性對照組的小鼠的血清，結(jié)果顯示感染組和