弓形蟲SAG5B和SAG1基因的克隆表達(dá)及其對小鼠免疫保護(hù)性研究.pdf

1、目的：克隆剛地弓形蟲RH株表膜的sag1以及一種新發(fā)現(xiàn)的基因sag5b，并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a/sag1和pET28a/sag5b，表達(dá)弓形蟲表膜蛋白SAG1和SAG5B。利用此重組蛋白免疫小鼠，觀察對小鼠的抗弓形蟲感染的能力。同時對照比較RH株弓形蟲基因組與Praugniud株弓形蟲基因組中sag5b基因，用于蟲株毒力鑒別的可能性。 方法：復(fù)蘇本室液氮保種的RH株弓形蟲速殖子，腹腔接種Balb/c小鼠，轉(zhuǎn)種3代，抽取腹

2、水，收集、純化弓形蟲速殖子，并用蛋白酶K裂解法提取基因組DNA，同時制備速殖子粗抗原并免疫新西蘭白兔，收集兔抗弓形蟲多抗血清。剖殺腦組織中含有Praugniud株弓形蟲包囊的小鼠，獲取含有包囊的腦組織。引物設(shè)計(jì)時分別在引物兩端引入：EcoRI和XhoI以及EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增出弓形蟲sag5b以及sag1基因片斷，目的基因sag5b以及sag1基因片斷插入克隆載體pGEM-T，提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定并獲得目的基因

3、，插入原核表達(dá)載體pET28a中，重組子雙酶切、PCR和測序鑒定，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoli BL21(DE3)并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。親和層析法純化重組蛋白，SDS-PAGE和Western blotting驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性，并用Lowry法測定純化rSAG5B及rSAG1蛋白濃度。將兩種純化的蛋白以及弓形蟲粗抗原分別皮下免疫Balb/c小鼠，再進(jìn)行攻擊感染，以觀察小鼠的存活情況。以佐劑為空白對照。 結(jié)果：利用PCR從RH株弓形

4、蟲基因組中克隆出1104bp的sag5b目的基因片段。成功地將其克隆入pET28a。sag5b-pET28a經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切，獲得與目的基因大小相一致的基因片段，測序結(jié)果與GenBank比對sag5b同源性100％。含sag5b-pET28a的宿主菌EcoliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)rSAG5B蛋白。分別以RH株弓形蟲基因組以及含有Praugniud株弓形蟲包囊的腦組織為模板，PCR法擴(kuò)增sag5b，只有在

5、RH株基因組中發(fā)現(xiàn)該基因。此外，利用PCR從RH株弓形蟲基因組中克隆出1101bp的sag1目的基因片段。將其克隆入pET28a載體。sag1-pET28a經(jīng)EcoRI和HindⅢ雙酶切，獲得與目的基因大小相一致的基因片段，測序結(jié)果與GenBank比對sag1同源性100％。含sag1-pET28a的宿主菌EcoliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)rSAG1。上述兩種重組蛋白經(jīng)Ni2+親和層析法純化獲得了高純度的rSAG5B和

6、rSAG1蛋白。SDS-PAGE檢測其分子量：rSAG5B為43KDa，rSAG1為30KDa，二者分別與各自的預(yù)期分子量大小相符。Western blotting顯示：rSAG5B與rSAG1蛋白都能夠被抗弓形蟲的多抗血清中的相應(yīng)抗體識別，獲得了兩種純化的具有特異免疫反應(yīng)的重組蛋白。將這兩個純化的重組蛋白以及制備的弓形蟲粗抗原分別與福氏佐劑乳化后皮下免疫Balb/c小鼠，同時以福氏佐劑為空白對照。每只小鼠的抗原用量為20μg，兩周后加

7、強(qiáng)一次，佐劑改為福氏不完全佐劑。末次免疫后一個月，用RH株弓形蟲速殖子腹腔注射小鼠進(jìn)行攻擊感染，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)rSAG5B和rSAG1與粗抗原對小鼠的免疫保護(hù)作用沒有顯著性差異(P>0.05)，而均比空白對照組(未免疫組)生存時間長，有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：成功地從弓形蟲RH株基因組中獲取了sag5b基因以及sag1，構(gòu)建了sag5b-pET28a/sag1-pET28a重組質(zhì)粒，并獲得了高效表達(dá)；對比RH株基因組