弓形蟲SAG2基因的測(cè)序、檢測(cè)及表達(dá).pdf

1、弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，引起人獸共患的弓形蟲病，可以通過肉食品感染人及動(dòng)物。建立靈敏的、快速的PCR檢測(cè)方法是必須的。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三方面的研究。 1.建立豬弓形蟲Nested-PCR檢測(cè)方法，弓形蟲基因組SAG2基因片斷設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的Nested-PCR檢測(cè)豬弓形蟲的方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果可檢測(cè)到每克肉10<'2>個(gè)弓形蟲基因組DNA水平；對(duì)新孢子蟲、隱孢子蟲、柔嫩艾美耳球蟲、豬肉孢子蟲牛球蟲

2、、伊氏錐蟲等種病原生物檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明此方法特異性強(qiáng)。將采自獸醫(yī)院門診及屠宰場(chǎng)的68份豬血清樣品分別用Nested-PCR和PAPS進(jìn)行平行檢測(cè)。PAPS初步檢測(cè)68份樣品，陽(yáng)性及可疑的血清樣品共計(jì)17份，PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣品16份。結(jié)論認(rèn)為，巢式PCR方法可用于弓形蟲早期感染的檢測(cè)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。 2.弓形蟲上海株DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增SAG2基因，通過與pGEM T-Easy ve

3、ctor連接、轉(zhuǎn)化JMl09、克隆、測(cè)序，得上海株弓形蟲SAG2基因序列與RH株高度相似。 3.SAG2-pGEM T-Easy vector為模板，擴(kuò)增編碼主要表面抗原P22的基因片段。將該基因片段播入T/A克隆，引入酶切位點(diǎn)，雙酶切、純化目的片段與PGEX-6p-1按一定比例T4連接。用PCR結(jié)合雙酶切的方法鑒定，核酸測(cè)序驗(yàn)證，將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體eP22-pGEX-6P-1轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中，用1mmol/L IPT