弓形蟲(chóng)復(fù)合基因疫苗SAG1-ROP2-GRA2的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng)，可感染人類及各種脊椎動(dòng)物，引起人獸共患弓形蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)呈世界性分布，人群普遍易感，多呈隱性感染，但在免疫抑制或免疫缺陷患者中(如器官移植、惡性腫瘤、AIDS、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等)可引起嚴(yán)重的器官損害(多見(jiàn)于腦和眼)，作為一種機(jī)會(huì)性致病因子是導(dǎo)致患者死亡的病原之一。婦女孕期首次感染弓形蟲(chóng)可引起流產(chǎn)，死胎或畸型。此外，由弓形蟲(chóng)引起的禽畜類疾病給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)

2、濟(jì)損失。迄今尚無(wú)治療弓形蟲(chóng)病的特效藥物，因此研制安全有效的疫苗對(duì)人類健康及畜牧業(yè)發(fā)展意義重大。 對(duì)弓形蟲(chóng)疫苗的研究經(jīng)歷了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗，DNA疫苗又包括單基因疫苗和復(fù)合基因疫苗。由于弓形蟲(chóng)生活史較復(fù)雜，抗原成分多，每種抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)有所不同，動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均表明，單價(jià)亞單位疫苗的免疫效果不太理想。因此，發(fā)展多種抗原組合、針對(duì)不同生活史發(fā)育階段的復(fù)合多價(jià)疫苗是研究弓形蟲(chóng)疫苗過(guò)程中的一個(gè)發(fā)展

3、方向與共識(shí)，這有助于克服單一抗原成分作為候選疫苗的不足。 SAG1抗原作為弓形蟲(chóng)速殖子表面的主要抗原之一，是迄今應(yīng)用最多的弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原。SAG1蛋白分布于弓形蟲(chóng)速殖子表膜、速殖子內(nèi)以及納蟲(chóng)泡的管狀結(jié)構(gòu)中，約占弓形蟲(chóng)體總蛋白的3-5％，卻可抑制患者血清中抗體活性的50％，說(shuō)明SAG1含量雖微，卻是速殖子的主要抗原成份，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原。能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG，IgM，IgE，IgA及sIgA，抗SAG1抗體在體

4、外有殺蟲(chóng)，在體內(nèi)有保護(hù)作用，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，如γ-干擾素和細(xì)胞毒性淋巴因子，其抗原特異性的CD8+T細(xì)胞能直接殺傷細(xì)胞外弓形蟲(chóng)，對(duì)弓形蟲(chóng)感染的腹腔巨噬細(xì)胞亦具有細(xì)胞毒性。 ROP2(rhoptry protein)存在于弓形蟲(chóng)速殖子、緩殖子及包囊期，分子量為54kDa，是棒狀體分泌的一種蛋白，它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以IgA，IgM，IgG為主的體液免疫。此外，ROP2可以被人特異性T細(xì)胞克隆識(shí)別而產(chǎn)生高水平的IFN-γ，后者

5、在控制弓形蟲(chóng)急性及慢性感染中可發(fā)揮重要作用。 GRA2是弓形蟲(chóng)納蟲(chóng)泡內(nèi)的致密顆粒細(xì)胞器分泌的一種致密顆粒蛋白(GRA)，分子量為28.5kDa，在編碼區(qū)有一個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)部存在螺旋結(jié)構(gòu)，為兩個(gè)不同性質(zhì)的a-螺旋，GRA2的抗原性很強(qiáng)，用純化的GRA2免疫小鼠，抗攻擊感染的小鼠存活率為75％。目前研究表明GRA2在急慢性弓形蟲(chóng)感染血清中普遍存在，至少存在3個(gè)B細(xì)胞表位和一個(gè)T細(xì)胞表位，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IgG，IgM，IgA多種抗體，激

6、活GRA2特異性的CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫。因此，GRA2作為弓形蟲(chóng)病的診斷抗原及可能的疫苗成分頗具有研究?jī)r(jià)值。 IL-12可強(qiáng)烈刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞分泌IFN-γ，繼之激活巨噬細(xì)胞提高其殺傷弓形蟲(chóng)活力，也能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，并增強(qiáng)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞殺傷功能。同時(shí)，IL-12對(duì)促進(jìn)IFN-γ的持續(xù)產(chǎn)生也起到重要作用。在弓形蟲(chóng)感染的急慢性其均起到重要作用。弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株不同其毒力也不同，感染弱毒株(

7、typeⅡ)可刺激DC、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-12，能早期誘導(dǎo)IL-12的高表達(dá)對(duì)控制弓形蟲(chóng)感染起到重要作用。相比之下感染強(qiáng)毒株(typrⅠ)所產(chǎn)生的IL-12的水平非常低。 該研究成功地把SAG1、ROP2、GRA2三個(gè)基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體pcDNA3.1上，以mIL-12作為基因佐劑，通過(guò)肌肉注射的方式免疫小鼠，觀察其免疫效果及佐劑增強(qiáng)作用。結(jié)果表明該復(fù)合基因疫苗的免疫效果明顯優(yōu)于其對(duì)照組的免疫效果，且I