剛地弓形蟲ROP16-ROP18復合基因真核表達載體的構建及其免疫保護性研究.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplsma gondii）是世界上最常見的寄生蟲之一，屬于專性細胞內(nèi)寄生的頂復門原生動物寄生蟲，可寄生在人和各種脊椎動物當中。由于其感染人體可以造成懷孕婦女流產(chǎn)或死胎、胎兒畸形等疾病以及會使免疫缺陷患者產(chǎn)生腦炎、視網(wǎng)膜炎等，甚至潛在致命風險，使其備受關注。弓形蟲棒狀體蛋白(TgROPs)是弓形蟲入侵和發(fā)揮毒力的關鍵因子，在蟲體入侵宿主細胞與后續(xù)繁殖過程中有著重要作用，同時也是治療和預防弓形蟲病的藥物作用靶點及疫苗候選

2、組分。本研究利用分子生物學手段構建了剛地弓形蟲ROP16和ROP18基因的復合基因真核表達重組質粒pVAXD-ROP16-ROP18，并將其轉染Hela細胞驗證其在真核細胞中的表達。用該重組質粒對BALB/c小鼠進行免疫后，通過對小鼠的相關免疫性指標進行測定來評估其對動物的免疫保護效果。
　　首先提取剛地弓形蟲速殖子總RNA，根據(jù)弓形蟲棒狀體蛋白16（TgROP16）與棒狀體蛋白18（TgROP18）基因的開放閱讀框架設計引物，采

3、用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法擴增ROP16和ROP18基因，將二者分別連入至真核表達載體pVAX1中，構建重組質粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18并轉化至大腸埃希菌（E.coli)XL1-Blue中。提取出陽性菌落質粒后對其進行PCR、酶切及基因測序驗證。結果顯示，TgROP16與TgROP18基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物與預期相符，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定該重組質粒構建正確。測序顯示獲得的TgROP16基因片段為2124

4、bp，獲得的TgROP18基因片段為1665bp，與GenBank已收錄的弓形蟲ROP16基因、ROP18基因序列一致性分別為99.8％與100％。結果表明克隆弓形蟲ROP16和ROP18基因成功。
　　隨后對載體pVAX1的多克隆位點進行改造，構建載體pVAXA和pVAXB，PCR擴增載體pVAXA中包含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表達單元片段，并將其連入載體pVAXB中，組建成具有兩個啟動子的表達載體pVAXD。將質

5、粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18中的目的基因ROP16、ROP18通過酶切連入載體pVAXD中，構建重組表達載體pVAXD-ROP16-ROP18，并對其構建成功與否進行PER及雙酶切驗證。接下來用重組表達載體pVAXD-ROP16-ROP18轉染并培養(yǎng)Hela細胞后利用RT-PCR法及間接免疫熒光法檢測兩個基因在真核細胞內(nèi)的表達。結果證實重組表達載體pVAXD-ROP16-ROP18經(jīng)PCR和雙酶切驗證構建正確，RT-

6、PCR檢測顯示，實驗組與對照組β-肌動蛋白基因擴增產(chǎn)物均與預期大小相符，實驗組能夠擴增出ROP16與ROP18基因，而對照組未擴增出二者基因。間接免疫熒光法檢測顯示，重組質粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18轉染組細胞可見綠色熒光，空質粒及對照組無綠色熒光。表明成功構建了重組質粒pVAXD-ROP16-ROP18，且實現(xiàn)了該質粒在真核細胞中表達ROP16與ROP18基因。
　　最后采取堿裂解法制備重組表達載體，并將等量

7、的重組質粒pVAXD-ROP16-ROP18、pVAXD-ROP16+pVAXD-ROP18、pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18、pVAXD與生理鹽水通過肌肉注射的方式，以2周一次的間隔時間對BALB/c小鼠連續(xù)免疫3次。收集各組小鼠每次免疫前1日和末次免疫2周后的血清并測定當中的特異性抗弓形蟲抗體水平及細胞因子含量;對末次免疫2周后各組小鼠進行速殖子腹腔注射攻擊實驗后評估各組的生存情況。結果顯示，各重組表達載體免疫組小鼠均