弓形蟲ROP18蛋白對宿主細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：研究弓形蟲棒狀體蛋白ROP18是否與弓形蟲抑制宿主細胞的凋亡有關。
　　方法:利用軟件設計擴增ROP18基因的引物，在ROP18基因上游引入Flag標簽序列，為方便下游克隆，在上游及下游引物的5’端分別引入BamHⅠ及HindⅢ酶切位點。酚-氯仿法提取弓形蟲RH株基因組DNA，以其為模板PCR擴增ROP18基因。利用試劑盒純化PCR產物，利用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切克隆到pcDNA3.1(+)真核表達載體的相同位點，構建

2、pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表達載體,DNA序列分析鑒定正確后,大量提取質粒,利用試劑盒去除內毒素，脂質體法轉染RAW264.7細胞表達。分離蛋白，SDS-PAGE及利用Flag標簽抗體進行Western blotting檢測ROP18在RAW264.7細胞中的表達。H2O2分別誘導不含重組質粒的RAW264.7細胞（對照組）、含重組質粒的RAW264.7細胞（轉染組）發(fā)生凋亡，于24h、48h分別檢測以下凋亡指標：

3、細胞爬片經HE染色后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，觀察細胞是否表現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)變化；分離線粒體及細胞漿進行Western blotting檢測細胞色素c在線粒體與胞漿中的分布，確定細胞色素C是否從線粒體釋放到胞漿；提取細胞基因組DNA進行瓊脂糖電泳EB染色后檢測DNA是否發(fā)生了凋亡特征性的梯狀片斷化。綜合以上實驗結果判斷弓形蟲ROP18蛋白對H2O2誘導的RAW264.7細胞凋亡是否具有抑制作用。
　　結果：
　　DNA序

4、列分析結果顯示正確構建了pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表達載體，Western blotting檢測到ROP18在RAW264.7細胞中的表達。H2O2誘導轉染組和對照組RAW264.7細胞凋亡的結果顯示：轉染組與對照組RAW264.7細胞形態(tài)均出現(xiàn)明顯的凋亡特征：細胞變圓，細胞膜皺縮，染色質濃縮；Western blotting檢測到細胞色素c在線粒體與胞漿中均有分布，說明細胞色素c從線粒體轉移至胞漿；DNA出現(xiàn)片斷