弓形蟲RH株ROP18重組犬Ⅱ型腺病毒的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的免疫研究.pdf

1、弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由專性細(xì)胞內(nèi)寄生的弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的呈世界范圍分布的機(jī)會(huì)致病性人獸共患寄生蟲病，WHO和FAO已將其列為值得全球關(guān)注的食源性寄生蟲病。它給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，也威脅著人類（特別是艾滋病病人、接受癌癥治療的病人及器官移植患者等）的生命安全，對(duì)世界公共衛(wèi)生安全提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由于目前仍沒有安全、有效的藥物根治弓形蟲病，因此研制安全、有效的抗弓形蟲病疫苗對(duì)于

2、弓形蟲病的預(yù)防具有重要意義。
　　病毒載體一般不具有返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，不僅可增強(qiáng)疫苗的活性，還能在適宜的細(xì)胞系中培養(yǎng)出表達(dá)目的外源基因蛋白的高滴度的重組病毒。在之前的研究中，我們課題組構(gòu)建表達(dá)弓形蟲 ROP18蛋白的真核表達(dá)載體作為核酸疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示此疫苗能夠延長RH株攻擊感染的小鼠的存活時(shí)間，但保護(hù)效力不太理想，因此，我們利用病毒載體代替真核表達(dá)載體，探尋重組病毒疫苗對(duì)小鼠是否具有更高效的保護(hù)效力。
　　本研究采用犬Ⅱ型

3、腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了含有弓形蟲RH株ROP18基因的重組腺病毒質(zhì)粒（pPloy2-CAV-2-ΔE3-ROP18），將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MDCK細(xì)胞進(jìn)行重組病毒的包裝，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE病變，通過 IFA鑒定重組病毒確實(shí)能夠特異性表達(dá)外源蛋白，成功獲得了能夠表達(dá)弓形蟲 ROP18蛋白的復(fù)制型重組腺病毒（CAV-2-ROP18）。利用重組病毒對(duì)昆明小鼠進(jìn)行肌肉注射接種，同時(shí)設(shè)置 CAV-2弱毒株陰性對(duì)照組、PBS陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組

4、，測定各組小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答指標(biāo)，評(píng)估重組病毒疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)效力。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAV-2-ROP18免疫組小鼠機(jī)體產(chǎn)生了有效的抗弓形蟲感染的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)：特異性IgG和IgG1抗體水平明顯升高；脾淋巴細(xì)胞SI顯著升高；淋巴細(xì)胞分泌了大量的IFN-γ、IL-2和少量的IL-4；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子 IFN-γ和TNF-α均上調(diào)；CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞發(fā)生活化，比率上升；顯著提高RH株感染小鼠的存活率（40％）；