弓形蟲ROP18的表達(dá)、純化及初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　 克隆剛地弓形蟲RH株速殖子棒狀體蛋白（rhoptryprotein，ROP）18基因編碼序列，進(jìn)行原核表達(dá)并制備多克隆抗體，采用間接免疫熒光技術(shù)(Indirectimmunofluorescenceassay，IFA)技術(shù)和免疫印跡(Westernblotting)技術(shù)檢測不同時(shí)間ROP18蛋白在蟲體內(nèi)分布及表達(dá)量的變化，為深入研究ROP18在弓形蟲入侵細(xì)胞中的作用提供基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 根

2、據(jù)ToxoDB基因庫中ROP18基因序列，DNAstar軟件設(shè)計(jì)并合成1對特異性引物。體外培養(yǎng)并收集弓形蟲RH株速殖子，提取其總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)得到弓形蟲cDNA。以cDNA為模板，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增ROP18基因片段，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒ROP18/pTG19-T和ROP18/pET-28a(+)，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，在大腸埃希菌Rosetta(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)。采用KCl染色切膠純化法

3、純化重組ROP18蛋白。
　　 純化的重組ROP18蛋白經(jīng)皮下注射免疫家兔，制備其兔多克隆抗體，采用Westernblotting技術(shù)和IFA技術(shù)對多克隆抗體進(jìn)行鑒定。
　　 選擇不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用IFA和Westernblotting技術(shù)定位和檢測ROP18在弓形蟲速殖子體內(nèi)的分布與表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 從弓形蟲RH株速殖子cDNA中擴(kuò)增出1665bp的ROP18基因片段成功構(gòu)建重組質(zhì)粒ROP1

4、8/pET-28a(+)，并在Rosetta(DE3)菌中大量表達(dá)，以包涵體形式存在。SDS-PAGE結(jié)果表明，67kDa處有一條明顯的蛋白表達(dá)條帶，與理論推測大小一致。采用KCl染色切膠純化法獲得純化的目的蛋白。
　　 以純化的重組蛋白免疫家兔獲得高效價(jià)的多克隆抗體。經(jīng)Westernblotting技術(shù)檢測出弓形蟲RH株速殖子在55kDa處有特異性條帶，IFA技術(shù)檢測速殖子內(nèi)ROP18分布于蟲體前端胞質(zhì)內(nèi)，與棒狀體位置基本一致

5、，表明成功制備ROP18多克隆抗體。
　　 IFA技術(shù)清晰可見不同時(shí)間點(diǎn)ROP18在弓形蟲體內(nèi)的分布，隨著感染時(shí)間的延長，綠色熒光逐漸增強(qiáng);采用Westernblotting技術(shù)檢測相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ROP18表達(dá)量的變化，結(jié)果表明，隨著感染時(shí)間延長ROP18表達(dá)量逐漸升高，與IFA結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒ROP18/pET-28a(+)，并將其導(dǎo)入大腸埃希氏菌Rosetta(DE3)中得到高效