弓形蟲ROP16的表達(dá)及其調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩93頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:
  將弓形蟲棒狀體16蛋白在體外表達(dá)并將其純化后,制備兔抗多克隆抗體。構(gòu)建ROP16真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,使其成功表達(dá)ROP16蛋白,探討ROP16對293T細(xì)胞凋亡的影響。
  方法:
  分別構(gòu)建重組質(zhì)粒ROP16/pTG19-T和ROP16/pET32a,并于Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)。通過KCl染色切膠法對重組蛋白進(jìn)行純化,制備多克隆抗體,并用Western blotting和IFA技術(shù)分別對

2、其進(jìn)行鑒定。
  構(gòu)建ROP16真核表達(dá)重組質(zhì)粒p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,并用PCR和雙酶切法進(jìn)行鑒定,提取無內(nèi)毒素陽性質(zhì)粒。采用瞬時轉(zhuǎn)染法使得重組蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá),在三個不同時間點(diǎn)收集標(biāo)本,用Wenstern blotting和RT-PCR法檢測分別定量和定性檢測ROP16在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
  將293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長至60%左右(≤24h),向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和p

3、3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16重組質(zhì)粒。使用0.5μg/ml Act D誘導(dǎo)凋亡。于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h收集標(biāo)本,分別用于以下實驗:將標(biāo)本用Annexin V-FITC/PI染色以及TUNEL BrightGreen試劑盒染色,檢測凋亡率。提取標(biāo)本中RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,RT-PCR法檢測Bcl-2/Bax及Caspase3的變化。
  結(jié)果:
  成功擴(kuò)增出ROP16基因片段并構(gòu)建ROP16原核表

4、達(dá)重組質(zhì)粒。電泳結(jié)果顯示99.8 kDa處有符合大小的條帶。將純化后重組蛋白免疫家兔并獲得多克隆抗體。Western blotting結(jié)果顯示在74 kDa處有符合大小條帶,IFA結(jié)果顯示目的蛋白的綠色熒光分布在弓形蟲速殖子的胞質(zhì)內(nèi),具體位置為細(xì)胞核前端。
  成功構(gòu)建真核表達(dá)重組載體p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后三個時間點(diǎn)的樣本經(jīng)Western blotting均能檢測出符合大小的條帶,根

5、據(jù)條帶的粗細(xì)判斷蛋白表達(dá)量與時間成正比。
  數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ROP16的實驗組凋亡率均低于對照組,并且在24h、48h兩組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后24 h、48 h,ROP16轉(zhuǎn)染組Bcl-2/Bax明顯高于空載轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。ROP16轉(zhuǎn)染組Caspase3與actin比值明顯低于空載轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
  結(jié)論:
  成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒ROP16/pET32a,并制備R

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論