弓形蟲通過STAT3-miR17~92-Bim信號通路調控人巨噬細胞凋亡的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:弓形蟲是一種人畜共患、廣泛傳播、專性寄生于溫血動物有核細胞內的機會性致病原蟲。在細胞內寄生的演化過程中,弓形蟲具備了通過多種途徑來抑制凋亡的機制,使蟲體獲得了繁殖與發(fā)育的充分條件,一方面有利于與蟲體的增值,另一方面也是引起宿主感染的持續(xù)和感染范圍播散的原因。宿主蛋白組定量分析表明,在弓形蟲感染階段,大量的宿主細胞蛋白質表達譜發(fā)生了改變。作為研究細胞內寄生原蟲的模型,弓形蟲從基因水平改變宿主細胞內蛋白質表達的機制,目前還未見報道。

2、miRNAs正是具有這種調節(jié)功能的RNA分子。miRNAs是一種細胞基因組的自身組分,具有高度的種屬特異性,通過與特定mRNA結合或調節(jié)特定mRNA的蛋白質翻譯過程來調控基因表達。miRNA已經成為生命科學的研究熱點之一。在正常狀態(tài)下,miRNAs受到穩(wěn)定的,完整的和平衡的轉錄因子、RNA結合蛋白等網(wǎng)絡調節(jié),對細胞環(huán)境的改變非常敏感。蟲體的侵入,作為一種細胞自身的“異物”,可改變宿主細胞的內環(huán)境,這必然會引起宿主細胞 miRNAs表達水

3、平的改變。
  目的:觀察弓形蟲感染人巨噬細胞是否可以改變宿主 miRNA表達譜;研究與凋亡相關的miRNA及其靶基因的相互作用及其調節(jié);初步揭示弓形蟲通過干擾宿主細胞基因,調節(jié)人巨噬細胞凋亡的機制及其相關的信號通路,為研究寄生蟲-宿主相互作用以及研發(fā)新型藥物提供理論和實驗依據(jù)。
  方法:利用星狀孢子素誘導細胞調亡途徑,弓形蟲感染后利用流式細胞儀檢測細胞調亡。利用Western blotting觀察凋亡途徑中關鍵蛋白Bim

4、的表達。利用高通量人類miRNAs基因芯片和qRT-PCR,分析弓形蟲感染正常人巨噬細胞后miRNA表達譜及其改變。通過生物信息學軟件分析 Bim與miR17~92 miRNAs的關系及miR17~92基因簇啟動子上游轉錄因子 STAT3的結合位點。然后利用 Western blotting觀察弓形蟲感染后細胞內STAT3(pSTAT3)的變化。構建miR17~92基因簇啟動子區(qū)域的熒光素酶報告基因(pGL3-Basic載體),與表達S

5、TAT3的表達質粒(pEZ-M02-STAT3-WT, pEZ-M02-STAT3-C)共轉染至 MΦ細胞內,檢測報告基因活性;構建Bim3’-UTRs片段(Bim-3′UTR-1, Bim-3′UTR-2和Bim-3′UTR-3)的熒光素酶報告基因(pSI-CHECK2載體),與表達 miR-17~92的質粒(pEZ-M02-miR-17~92)或 miR-17-5p抑制體及miR-20a抑制體共轉染至M細胞內,檢測報告基因活性。

6、r>  結果:(1)弓形蟲感染的MΦ的早期凋亡率明顯下降;
 ?。?)弓形蟲感染后導致MΦ內Bim表達下降;
 ?。?)通過miRNA基因芯片分析,弓形蟲感染導致MΦ內miR17~92基因簇編碼的miRNA表達顯著升高;
 ?。?)熒光素酶實驗結果顯示,miR17~92基因簇所編碼的miRNAs通過可結合Bim3′UTR區(qū),抑制Bim蛋白的表達;Western blotting結果顯示,miR17~92 miRNAs過

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