豬巨噬細胞感染不同基因型弓形蟲后的轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、剛地弓形蟲是人獸共患寄生蟲病，可以感染幾乎所有的溫血動物，通過其分泌蛋白改變宿主細胞的信號通路狀態(tài)、調(diào)節(jié)宿主基因的表達量，進而影響宿主的生命活動進程。根據(jù)弓形蟲感染小鼠的毒力可以分為:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年來，隨著經(jīng)濟的增長，人們生活水平的不斷提高，對豬肉的需求大幅上漲，然而豬弓形蟲病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，同時也造成了我國居民弓形蟲感染率的上升。由于目前對弓形蟲病防控的基礎(chǔ)研究不足，尤其是對弓形蟲與宿主之間相互作用的分子機

2、制尚不清楚。因此，國內(nèi)外許多科研工作者建立動物模型，用于研究對弓形蟲與宿主之間相互作用的分子機制。
　　本研究利用RNA-Seq高通量測序研究不同基因型弓形蟲對豬巨噬細胞感染后的轉(zhuǎn)錄組變化，鑒定出弓形蟲感染細胞后的差異表達的基因及免疫途徑，發(fā)現(xiàn)不同基因型弓形蟲在調(diào)控型Ⅰ干擾素和NF-κB信號通路的差異，通過弓形蟲感染BALB/c小鼠，利用Real-time PCR檢測小鼠脾臟中細胞因子的變化，同時利用Western Blot研究G

3、RA15調(diào)控NF-κB信號通路的分子機制，將質(zhì)粒GRA15電轉(zhuǎn)到RAW264.7細胞，研究其對免疫因子的影響。
　　(1)不同基因型弓形蟲的速殖子感染3D4/21細胞后的轉(zhuǎn)錄組分析
　　將RH、HB1和ME49弓形蟲速殖子感染3D4/21細胞，利用RNA-Seq高通量測序檢測6h、12h和24h時間點轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)差異表達基因隨著感染時間的延長而增加，Ⅱ型蟲株誘導(dǎo)的差異表達基因明顯高于Ⅰ型蟲株，進行GO富集和KEGG分析

4、，三種弓形蟲速殖子在涉及巨噬細胞的免疫或疾病相關(guān)途徑存在差異。
　　(2)不同基因型弓形蟲對小鼠脾臟的免疫因子的影響
　　通過腹腔接種弓形蟲Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠，根據(jù)不同基因型弓形蟲的毒力，設(shè)置不同的時間間隔來定時收取脾臟組織。利用Real-time PCR技術(shù)檢測小鼠先天性免疫細胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相對表達量。結(jié)果顯示，在RH、HB1急性感染和Me4

5、9慢性感染中，IFN-γ和IL-10的表達變化十分明顯，且均在感染后期有著很高的表達量。而相對地，PD-1在各基因型弓形蟲感染中所誘導(dǎo)的表達量較低，且隨時間變化不太明顯。
　　(3)GRA15激活NF-κB信號通路的分子機制
　　將GRA15質(zhì)粒脂質(zhì)轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞，利用Western blot檢測細胞中IκB和p-IκB的表達，發(fā)現(xiàn)p-IκB的表達水平顯著增加，當(dāng)使用IκB激酶抑制劑MG-132后p-IκB表達水平

6、明顯減少。結(jié)果說明GRA15有可能是通過降解IκB蛋白來激活NF-κB信號通路。
　　(4)GRA15對RAW264.7細胞因子的影響
　　使用電穿孔法將GRA15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞中，分別收集12h和24h的細胞，通過Real-time PCR檢測細胞因子的表達水平。實驗結(jié)果表明，GRA15(-4)可以引起細胞IFN-β表達量的顯著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)則可以激活并誘導(dǎo)細胞分泌IFN-γ;而G

7、RA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)對IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均無明顯影響。
　　本研究首次對豬肺泡巨噬細胞(3D4/21)感染不同基因型弓形蟲后的轉(zhuǎn)錄組進行了研究和分析，描述了細胞感染弓形蟲后差異基因的表達變化。同時，在不同時間點鑒定的功能性差異表達基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御機制，促進對弓形蟲感染的預(yù)防和控制，了解這些途徑提供的信息可能對開發(fā)合理設(shè)計的弓形蟲治療劑和疫苗至關(guān)