弓形蟲(chóng)感染對(duì)雄性生殖損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)病是一種世界范圍內(nèi)廣泛存在的人獸共患性疾病，是豬、羊等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物感染性繁殖障礙的重要原因，同時(shí)也是人類(lèi)生殖健康損害的感染性因素之一。弓形蟲(chóng)作為專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的重要機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，進(jìn)入宿主機(jī)體后，能引起包括生殖系統(tǒng)在內(nèi)的多臟器損害。弓形蟲(chóng)可侵入雄性生殖系統(tǒng)，如睪丸、前列腺、附睪等，引起弓形蟲(chóng)性睪丸炎或雄(男)性不育。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠對(duì)弓形蟲(chóng)感染高度易感，常用于建立急性弓形蟲(chóng)病研究的動(dòng)物模型；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠對(duì)弓形蟲(chóng)感染則與人類(lèi)、豬、羊等的感染

2、相類(lèi)似，呈現(xiàn)一種亞臨床感染經(jīng)過(guò)，因此常用于人類(lèi)弓形蟲(chóng)病亞臨床感染的比較研究。本研究目的是將清潔級(jí)雄性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠和大鼠為研究對(duì)象，建立弓形蟲(chóng)感染的雄性動(dòng)物模型；同時(shí)將純化的弓形蟲(chóng)速殖子與正常生育男性精子一起孵育，建立弓形蟲(chóng)人工感染精子的實(shí)體模型；以此研究弓形蟲(chóng)感染對(duì)雄性生殖的損害作用與一些可能的作用機(jī)制，同時(shí)探討阿奇霉素對(duì)大鼠雄性生殖損害的藥物控制效果。主要研究?jī)?nèi)容包括： 一、弓形蟲(chóng)感染對(duì)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠和大鼠的雄性生殖損害

3、 1、弓形蟲(chóng)感染對(duì)小鼠雄性生殖機(jī)能的影響 將1×10<'3>/mL弓形蟲(chóng)(RH株)速殖子懸液0.3mL腹腔接種清潔級(jí)NIH小鼠，感染4天后，將感染小鼠睪丸制成直接印片及病理切片，觀(guān)察小鼠睪丸的病理學(xué)變化及弓形蟲(chóng)侵入生精細(xì)胞情況，并對(duì)弓形蟲(chóng)感染小鼠的睪丸乳酸脫氫酶一同工酶、精子密度、精子活力、精子畸形數(shù)，以及與正常雌鼠交配后雌鼠的懷孕活胎數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：弓形蟲(chóng)急性感染小鼠睪丸直接印片中可見(jiàn)生精細(xì)胞胞質(zhì)及核內(nèi)弓形蟲(chóng)速殖子

4、，睪丸切片病理學(xué)改變?yōu)樯?xì)胞胞質(zhì)空泡性變。弓形蟲(chóng)急性感染小鼠的睪丸乳酸脫氫酶一同工酶活性、精子密度、精子活力、以及與正常雌鼠交配后雌鼠懷孕活胎數(shù)，均比正常對(duì)照低，但精子畸形數(shù)則顯著升高(P<0.05)。提示：弓形蟲(chóng)感染對(duì)雄性小鼠的生殖機(jī)能有明顯的影響。 2、弓形蟲(chóng)感染對(duì)大鼠的雄性殖損害 將2×10<'5>/mL速殖子腹腔接種成年雄性SD清潔級(jí)大鼠，感染9周后，對(duì)大鼠血清性激素、精子數(shù)、精子活率、活力、精子質(zhì)量

5、、睪丸酶活性及睪丸組織的病理學(xué)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)將雄性弓形蟲(chóng)感染大鼠與正常雌性成年SD大鼠按1:2合籠交配1周，于妊娠第21天解剖雌性大鼠，檢查雌鼠的黃體數(shù)、胎鼠的性別、體重、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)等。結(jié)果表明：弓形蟲(chóng)感染9周，大鼠的睪丸和附睪的相對(duì)重量有所下降，精子數(shù)、活力、活率降低，血清性激素睪酮水平下降，睪丸組織呈明顯的形態(tài)學(xué)變化。與弓形蟲(chóng)感染雄}生大鼠成功交配的雌性大鼠的受孕率和產(chǎn)仔數(shù)均顯著減少，但胎鼠的平均體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)和胎鼠的性別比例與對(duì)

6、照組比較無(wú)顯著性差異。提示：弓形蟲(chóng)感染對(duì)大鼠雄}生生殖系統(tǒng)和雄性生育功能均有—定程度的損害。 3、弓形蟲(chóng)速殖子體外對(duì)人類(lèi)精子運(yùn)動(dòng)功能的影響 將經(jīng)CF-11純化的活弓形蟲(chóng)(RH株)速殖子懸液，對(duì)10例健康生育男性手淫獲得、并經(jīng)上游優(yōu)化處理的精子進(jìn)行體外感染孵育。按弓形蟲(chóng)速殖子的蟲(chóng)體含量分成A組(1×10<'3>/mL)、B組(1×10<'4>/mL)、C組(1×10<'5>/mL)、D組(1×10<'6>/mL)、E組(1

7、×10<'7>/mL)、F組(空白對(duì)照組)，分別孵育，并于0、1、2、4 h后取樣，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)，分別檢測(cè)其精子運(yùn)動(dòng)的直線(xiàn)速度、曲線(xiàn)速度、平均路徑速度、頭部側(cè)擺幅度、前向性運(yùn)動(dòng)百分率等參數(shù)，觀(guān)察精子存活率，精子形態(tài)及凝集情況。另將1×10<'5>/mL純化的活弓形蟲(chóng)速殖子懸液，在體外與15例經(jīng)上游優(yōu)化處理的生育男性精子一起孵育0、2、4、8、16、24 h后，檢測(cè)其精子運(yùn)動(dòng)方式參數(shù)。結(jié)果顯示：弓形蟲(chóng)速殖子與精子

8、體外孵育后，其精子運(yùn)動(dòng)速度和前向運(yùn)動(dòng)百分率等隨蟲(chóng)體含量增加及孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其他參數(shù)與對(duì)照組相比也相繼出現(xiàn)顯著性差異。1×10<'5>/mL弓形蟲(chóng)速殖子在體外與精子孵育8 h后，精子運(yùn)動(dòng)速度顯著下降。孵育8 h、16 h后的精子運(yùn)動(dòng)方式為原地轉(zhuǎn)圈和鋸齒形運(yùn)動(dòng)，孵育24 h后，精子的運(yùn)動(dòng)速度小于10 μm/s，有活力精子則全是原地轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)。并觀(guān)察到精子凝集和蟲(chóng)體黏附現(xiàn)象。提示：弓形蟲(chóng)速殖子體外可顯著降低精子存活率和抑制精子運(yùn)動(dòng)功能，

9、弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)精子運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)方式有明顯影響。其機(jī)制可能與弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)人類(lèi)精子的黏附作用和蟲(chóng)體侵入精子形成精子損傷等有關(guān)。 二、弓形蟲(chóng)感染對(duì)小鼠和大鼠雄性生殖損害作用的可能機(jī)制研究 1、弓形蟲(chóng)感染對(duì)小鼠睪丸組織細(xì)胞周期和生精細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弓形蟲(chóng)(RH株)感染10<'3>/mL、10<'4>/mL、10<'6>/mL 3個(gè)劑量組小鼠睪丸組織細(xì)胞周期，并設(shè)生理鹽水和環(huán)磷酰胺對(duì)照組。應(yīng)用瑞．姬染

10、色和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧核苷酸原位末端標(biāo)記法對(duì)弓形蟲(chóng)腹腔感染0.2mL×10<'5>/mL小鼠的睪丸生精細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：不同劑量的弓形蟲(chóng)感染均可使小鼠睪丸組織細(xì)胞各時(shí)相的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)發(fā)生變化，并隨著劑量的增加，G<,0>/C<,1>、S時(shí)相的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯減少，與陰性對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.05)。G<,2>/M時(shí)相的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸增多，各劑量組與陰性對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.05)。弓形蟲(chóng)腹腔感

11、染小鼠的睪丸生精細(xì)胞凋亡率顯著高于正常。提示：弓形蟲(chóng)感染可能抑制小鼠睪丸細(xì)胞的DNA合成，可引起G<,2>期細(xì)胞阻滯，從而使細(xì)胞的有絲分裂延伸。并且弓形蟲(chóng)感染可能有促進(jìn)小鼠生精細(xì)胞凋亡的作用。 2、弓形蟲(chóng)感染對(duì)大鼠T細(xì)胞免疫功能的動(dòng)態(tài)研究 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)腹腔感染經(jīng)CF-11纖維素純化的活弓形蟲(chóng)(RH株)速殖子2×10<'5>/mL懸液2 mL后第3、7、14、21、28、35、42、60 d大鼠外周血CD3<'+

12、>、CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞的百分率，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定其外周血IFN-γ、TNF-α、IL-4等細(xì)胞因子水平。結(jié)果表日月 CD8<'+>T細(xì)胞亞群水平在感染弓形蟲(chóng)后3 d、7 d、14 d、21 d時(shí)均顯著低于正常水平(P<0.05)，至感染后28 d恢復(fù)至正常。而CD4<'+>T細(xì)胞亞群水平在整個(gè)感染過(guò)程中則無(wú)顯著性變化。CD4<'+>/CD8<'+>比值升高，以感染后第14 d最為明顯；大鼠外周血中IFN-

13、γ和IL-4水平在感染后7 d開(kāi)始升高(P<0.05)，至感染后60 d時(shí)仍高于正常水平，TNF-α至感染后28 d時(shí)方高于正常(P<0.05)，至感染后60d時(shí)也仍高于正常水平。結(jié)果提示：大鼠感染弓形蟲(chóng)初期(急性期)可引起其T細(xì)胞亞群的分布失衡，但隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而得到修復(fù)。 3、弓形蟲(chóng)感染對(duì)大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響 腹腔感染2×10<'5>/mL活的純化弓形蟲(chóng)速殖子懸液(CF-11纖維素純化)2mL于SD大鼠，建

14、立大鼠弓形蟲(chóng)病模型。9周后解剖大鼠，取睪丸制成睪丸組織單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。結(jié)果表明：弓形蟲(chóng)感染大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。提示：弓形蟲(chóng)感染可引起大鼠睪丸組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。 三、弓形蟲(chóng)感染對(duì)大鼠雄性生殖損害的藥物控制研究 通過(guò)對(duì)腹腔感染弓形蟲(chóng)的雄性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠模型進(jìn)行藥物治療實(shí)驗(yàn)，開(kāi)展了阿奇霉素對(duì)弓形蟲(chóng)感染大鼠雄性生殖系統(tǒng)和雄性生育力的保護(hù)作用研究，并從睪丸細(xì)胞