人-兔嵌合型抗弓形蟲IgM抗體基因庫的構建和抗弓形蟲IgG抗體參考物質的研究.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種可寄生于有核細胞的原蟲，能感染人和動物，引發(fā)弓形蟲病。成年人多為隱形感染，但對于某些特定人群，感染可引起嚴重的臨床癥狀，這些人群包括孕婦、艾滋病、器官移植、惡性腫瘤患者等。臨床實驗室弓形蟲檢測主要依靠免疫血清學檢測，檢測項目通常包括特異IgM和IgG等。在檢測中，為了排除假陰性結果，控制檢驗操作過程，保證檢測結果準確可靠，需要陽性質控品進行室內質量控制和室間質量評價。我們前期的研究采

2、用基因工程抗體技術將鼠的抗弓形蟲P30抗原IgG抗體可變區(qū)基因與人IgM抗體恒定區(qū)基因進行了拼接，在哺乳動物細胞中表達得到了鼠-人嵌合抗弓形蟲IgM抗體，對嵌合抗體作為IgM檢測質控替代品進行了探索，但是此嵌合抗體僅針對弓形蟲P30抗原，不能完全模擬人血清樣本中的能針對弓形蟲多個抗原多個表位的特異性抗體。針對此問題，本課題中我們擬用弓形蟲天然抗原免疫家兔，測定效價后取兔外周血單個核細胞，經淋巴細胞分離液處理后提取總RNA，逆轉錄獲得cD

3、NA，作為模板，分別擴增兔抗弓形蟲抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因庫，分別與人輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)基因重組，制備了人-兔嵌合型抗弓形蟲IgM抗體輕鏈和重鏈基因庫，未來其在哺乳動物細胞中表達后可得到多克隆抗體，或可從中進一步篩選出高親合力的人-兔嵌合基因工程抗體，二者均可作為質控品的替代品。該嵌合型輕、重鏈基因庫的成功克隆和人源化表達質粒的構建為下一步人源化人-兔嵌合型抗弓形蟲抗體IgM抗體的表達和高親合力抗體的篩選打下了基礎，并向人-兔嵌合型

4、抗弓形蟲抗體IgM作為弓形蟲抗體IgM檢測質控品的應用邁進了一步。
　　弓形蟲特異IgG抗體的免疫血清學檢測方法有多種，以酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光方法在臨床實驗室篩查檢測中最為常用。目前我國能提供該檢測試劑的廠家有多個，原理基本是間接法。無論采用何種檢測方法和試劑，保證在不同實驗室、不同試劑和方法間檢測的結果具有可比性十分重要，這就是臨床檢驗標準化的目的，實現(xiàn)臨床檢驗標準化或結果可比性的重要前提是要有統(tǒng)一的量值溯源。為此，英國國家生物

5、學標準物質和質控物研究所(National Institute for Biological Standards andControl，NIBSC)于2004年研制并提供了人抗弓形蟲特異IgG抗體的國際標準品，編號為01/600，含量值為20 IU，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）認定為第一代抗弓形蟲IgG抗體國際標準物質。然而，國際標準物質不但較難獲取，且價格非常昂貴，不適用于我國臨床實驗室

6、大規(guī)模使用，而此類標準物質的研制又是有效開展醫(yī)療衛(wèi)生工作的需要。因此，本研究參照了有關標準，研制了抗弓形蟲IgG血清學參考物質，并取得國家一級標準物質證書（編號:GBW09192），建立和應用可溯源到國際標準的我國自己的標準物質。應用該參考物質，將不僅使我國人類抗弓形蟲IgG血清學檢測結果具有可比性，而且有了溯源性。其應用范圍包括:
　　(1)不同試劑、不同檢測方法檢測下限的確定;
　　(2)依據(jù)該參考物質制備的標準系列血清