基于量子點(diǎn)和免疫磁珠技術(shù)同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和影響優(yōu)生優(yōu)育的人畜共患疾病。ELISA法是目前診斷弓形蟲(chóng)感染的常規(guī)檢測(cè)方法，主要是通過(guò)檢測(cè)特異性IgG(免疫力水平指標(biāo))和IgM(近期感染指標(biāo))抗體的有無(wú)來(lái)判斷機(jī)體的感染情況，但該方法存在不能同步檢測(cè)IgG和IgM抗體，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，耗費(fèi)試劑多，操作繁瑣等缺點(diǎn)。 量子點(diǎn)是一種新型熒光標(biāo)記材料，與傳統(tǒng)熒光染料相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：激發(fā)波長(zhǎng)范圍較寬，同一波長(zhǎng)的光能激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)；發(fā)射波長(zhǎng)窄而對(duì)稱(chēng)，同時(shí)

2、使用具有不同光譜特征的量子點(diǎn)時(shí)，發(fā)射光譜間重疊較少；不同粒徑和組成的量子點(diǎn)其發(fā)射波長(zhǎng)不同。因此，應(yīng)用不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)對(duì)不同的待檢分析物同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，可以達(dá)到多個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的目的。 本研究將量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)相結(jié)合，研制了一種可同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體的檢測(cè)體系，本方法不僅操作簡(jiǎn)便快速，還具有較高的特異性和敏感性，可用于弓形蟲(chóng)感染的篩查。 方法： 1.抗原固化磁性微球 采用碳二亞胺

3、交聯(lián)法將弓形蟲(chóng)重組抗原固化在羧基磁性微球表面。通過(guò)EDC和NHS溶液活化磁珠表面羧基后，活化的羧基再與抗原上的氨基進(jìn)行反應(yīng)，從而將弓形蟲(chóng)抗原固化在磁性微球表面，獲得免疫磁珠。通過(guò)對(duì)磁性微球的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度等固化條件進(jìn)行選擇優(yōu)化，建立穩(wěn)定、高效的免疫磁性微球固化方法。 2.量子點(diǎn)標(biāo)記二抗 采用碳二亞胺交聯(lián)法將羧基化CdS/ZnS量子點(diǎn)與抗體進(jìn)行標(biāo)記.分別以發(fā)射波長(zhǎng)為580nm、618nm的量子點(diǎn)分別標(biāo)記羊抗

4、人IgG和羊抗人IgM抗體，研究pH值，二抗加入濃度，反應(yīng)時(shí)間對(duì)量子點(diǎn)發(fā)光的影響，制備適用于抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體同步檢測(cè)體系的量子點(diǎn)標(biāo)記二抗試劑。 3.分別建立抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體檢測(cè)方法 以固化了弓形蟲(chóng)抗原的磁性微球作為固相載體，量子點(diǎn)標(biāo)記二抗作為檢測(cè)抗體，采用間接法原理，分別建立抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體的檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。分別檢測(cè)人抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM標(biāo)準(zhǔn)品，觀察本方法的線(xiàn)性范圍、靈敏度

5、、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。收集臨床標(biāo)本，分別用本方法與進(jìn)口ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，觀察兩種檢測(cè)方法的結(jié)果有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體同步檢測(cè)體系的構(gòu)建 在已建立的單個(gè)抗體檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)關(guān)鍵檢測(cè)條件進(jìn)行統(tǒng)一和優(yōu)化，構(gòu)建抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體同步檢測(cè)體系。同步檢測(cè)人抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM標(biāo)準(zhǔn)品，觀察該體系的線(xiàn)性范圍、靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。用已構(gòu)建的同步檢測(cè)體系對(duì)280例臨床標(biāo)本進(jìn)行同

6、步檢測(cè)，并將結(jié)果與進(jìn)口ELISA試劑盒進(jìn)行比較，探討多指標(biāo)同步檢測(cè)的可行性。 主要結(jié)果： 一、方法學(xué)建立 (1)抗原固化磁性微球 選擇粒徑為3μm的羧基磁性微球作為固相載體，加入EDC(6mg/ml)和NHS(4mg/ml)溶液進(jìn)行活化，弓形蟲(chóng)抗原的最適固化濃度為50μg/mL，固化效率為54.2％。 (2)量子點(diǎn)標(biāo)記二抗 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，量子點(diǎn)標(biāo)記二抗的最適反應(yīng)pH值為6.0，羊抗人IgG

7、、IgM抗體的最適標(biāo)記濃度分別為40μg/mL、50μg/mL。 (3)抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體檢測(cè)方法的建立 分別建立了抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體檢測(cè)方法，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，量子點(diǎn)羊抗人IgG、IgM的最適工作濃度分別為1:50、I:100，待測(cè)血清最適稀釋度均為1:100。通過(guò)檢測(cè)200例健康人血清樣本確定了抗弓形蟲(chóng)IgG抗體和IgM抗體Cutoff值分別為：0.45、0.44。 (4)同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和

8、IgM抗體檢測(cè)體系的建立 同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體，量子點(diǎn)標(biāo)記羊抗人IgG、IgM的最適工作濃度分別為1:200、1:100，待測(cè)血清最適稀釋度為1:100。檢測(cè)200例健康人血清樣本確定了抗弓形蟲(chóng)IgG抗體和IgM抗體Cutoff值分別為：0.55、0.51。同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體兩個(gè)指標(biāo)，僅需30min就可完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，而常規(guī)ELISA方法一次只能檢測(cè)單個(gè)指標(biāo)，完成兩個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)往往需要4h。

9、 二、方法學(xué)評(píng)價(jià) (1)抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體檢測(cè)方法的方法學(xué)評(píng)價(jià) 按已建立的方法分別檢測(cè)人抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM標(biāo)準(zhǔn)品，其最低檢測(cè)限分別為：3.04IU/ml、3.11 IU/ml。批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV分別5.2％、5.4％，天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV分別為6.5％，6.6％。準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)偏倚系數(shù)分別為：6.0％，6.3％。20例其它TORCH系列陽(yáng)性血清標(biāo)本與本方法均無(wú)交叉反應(yīng)。阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，弓形蟲(chóng)IgG和Ig

10、M抗體的阻斷率均在50％以上。 (2)同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體檢測(cè)體系的方法學(xué)評(píng)價(jià) 同步檢測(cè)人抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM標(biāo)準(zhǔn)品，其最低檢測(cè)限分別為：4.211U/ml、4.321U/ml；批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV分別為：6.0％、6.2％；天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV為7.2％、7.4％；準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)偏倚系數(shù)分別為：7.6％，7.2％。 三、方法學(xué)比較 (1)抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體檢測(cè)方法的方法學(xué)評(píng)價(jià)

11、 收集臨床標(biāo)本，用已建立的抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體檢測(cè)方法分別進(jìn)行檢測(cè)，并與進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較?？构蜗x(chóng)IgG和IgM抗體檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為：96.5％、96.8％，采用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)X2檢驗(yàn)分析，P值均>0.05，認(rèn)為兩種方法分別檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。 (2)同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體檢測(cè)體系的方法學(xué)評(píng)價(jià) 收集臨床標(biāo)本，用已構(gòu)建的抗弓形

12、蟲(chóng)IgG、IgM抗體同步檢測(cè)體系進(jìn)行同步檢測(cè)，并與進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較。弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為：96.4％，97.1％，采用SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)X2檢驗(yàn)分析，P值均>0.05，認(rèn)為本方法同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體的測(cè)定結(jié)果與ELISA法無(wú)顯著性差異。 結(jié)論： 1.以磁性微球作為固相載體，在其表面成功固化了弓形蟲(chóng)重組抗原，固化效率最高可達(dá)54.2％。利用磁珠可快速富

13、集的特性，在加快了檢測(cè)速度同時(shí)，也極大的提高了檢測(cè)靈敏度。本法同步檢測(cè)抗弓形蟲(chóng)IgG和IgM抗體僅需30 min，較ELISA法的2.5h明顯加快。 2.建立的抗弓形蟲(chóng)IgG、IgM抗體單指標(biāo)檢測(cè)方法，其靈敏度、檢測(cè)范圍、重復(fù)性、穩(wěn)定性等達(dá)到臨床初步應(yīng)用的要求，為同步檢測(cè)體系的建立奠定了基礎(chǔ)。 3.選用不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)分別標(biāo)記不同二抗，經(jīng)同一激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射兩種不同波長(zhǎng)的光，實(shí)現(xiàn)了多指標(biāo)的同步檢測(cè)，為基于量子點(diǎn)標(biāo)記同