TALEN和CRISPR技術(shù)在弓形蟲(chóng)致病機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf

1、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于基因的研究越來(lái)越透徹，基于基因的遺傳改造技術(shù)也取得了飛速的發(fā)展。從ZFN到TALEN再到后來(lái)的CRISPR技術(shù)，短短八年時(shí)間，DNA靶向技術(shù)便經(jīng)歷了幾次大的變革。由此也引發(fā)了以弓形蟲(chóng)為模式生物的頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)基因研究的技術(shù)突破。弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng)，可引起嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病，給人類(lèi)的生育健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重的危害。盡管關(guān)于弓形蟲(chóng)的基礎(chǔ)研究已經(jīng)取得了一定的成果，但在致病機(jī)制等方面仍知之甚

2、少。這些新興的遺傳操作技術(shù)為此帶來(lái)了突破的機(jī)會(huì)。
　　本研究首先應(yīng)用TALEN技術(shù)針對(duì)入侵的關(guān)鍵因子RON2進(jìn)行移碼突變，隨后以DNA疫苗的形式對(duì)其各功能區(qū)進(jìn)行免疫保護(hù)性驗(yàn)證;然后利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)比較分析GRA7，ROP17，ROP18在本地分離株(T.gHB1)的毒力作用;構(gòu)建了調(diào)控弓形蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)錄的CRISPR-dCas9抑制表達(dá)系統(tǒng)。
　　1.TALEN技術(shù)介導(dǎo)的RON2的功能失活及RON2各功能域的免疫保

3、護(hù)力驗(yàn)證
　　根據(jù)RON2基因序列設(shè)計(jì)DNA靶點(diǎn)識(shí)別域，并構(gòu)建相應(yīng)的TALEN質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染后根據(jù)RFP和GFP雙熒光信號(hào)對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行篩選驗(yàn)證，以PCR和測(cè)序的方法鑒定靶點(diǎn)結(jié)合域的序列突變。結(jié)果顯示TALEN質(zhì)粒成功誘導(dǎo)了RON2的移碼突變，但由于RON2的功能缺失導(dǎo)致蟲(chóng)體入侵受阻，未分離到單克隆蟲(chóng)株。對(duì)RON2基因功能域進(jìn)行分析，分別構(gòu)建了三個(gè)pcDNA3.1-RON2(1/2/3)真核表達(dá)質(zhì)粒，以100μg/只小鼠的劑量分別于0d,

4、14 d，28 d，42 d進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示，RON2-1/2/3均刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IFN-γ，但僅有RON2-3免疫組對(duì)小鼠有16.7％的免疫保護(hù)力。結(jié)果證實(shí)，RON2的胞外結(jié)構(gòu)域可作為疫苗候選分子用于弓形蟲(chóng)疫苗的研究。
　　2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的HB1弓形蟲(chóng)毒力相關(guān)因子的敲除
　　首先，分別構(gòu)建識(shí)別GRA7，ROP17，ROP18的CRISPR-Cas9-sgRNA質(zhì)粒和用于同源重組修復(fù)的質(zhì)粒（含GF

5、P、DHFR*或CAT篩選標(biāo)記）;轉(zhuǎn)染后的蟲(chóng)體經(jīng)診斷PCR、Western-blot等鑒定最終獲得ΔGRA7、ΔROP17、AROP18、ΔGRA7ΔROP17、ΔGRA7ΔROP18五個(gè)敲除蟲(chóng)株;通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)和小鼠攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲除蟲(chóng)株的生物學(xué)特性。最終空斑結(jié)果表明五個(gè)突變株在體外培養(yǎng)過(guò)程中與野生型沒(méi)有生長(zhǎng)速度上的明顯差異;攻蟲(chóng)結(jié)果顯示ΔGRA7、ΔROP17、ΔROP18表現(xiàn)出不同程度的毒力下降，ΔGRA7ΔROP17、ΔGRA7ΔR

6、OP18表現(xiàn)出與ΔROP17、ΔROP18相似的毒力下降。結(jié)果表明GRA7，ROP17和ROP18等毒力因子在HB1株中發(fā)揮重要的毒力作用，與RH株致病模式存在差異。
　　3.基于CRISPR-dCas9系統(tǒng)對(duì)弓形蟲(chóng)SAG1啟動(dòng)子的抑制調(diào)控
　　利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)以SAG1P∷RFP-SAG13'替代UPRT構(gòu)建一株穩(wěn)定表達(dá)RFP的弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株;通過(guò)缺失切割活性的dCas9和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（KRAN）來(lái)構(gòu)建CRISP

7、R-dCas9抑制系統(tǒng);構(gòu)建多個(gè)識(shí)別SAG1啟動(dòng)子的CRISPR-dCas9質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控試驗(yàn)，通過(guò)熒光鏡檢的方法對(duì)SAG1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，sgRNA結(jié)合在SAG1啟動(dòng)子-316至-297 bp處，pCRISPR-dCas9-KRAB-sgSAG1的結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)弓形蟲(chóng)內(nèi)源基因SAG1和外源基因RFP的顯著抑制。
　　本研究通過(guò)TALEN技術(shù)誘導(dǎo)了RON2的移碼突變，證實(shí)了RON2不可替代，并通過(guò)DNA疫苗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了