弓形蟲“遲發(fā)型死亡”機(jī)制的研究.pdf

1、目的：弓形蟲病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患病寄生蟲病，可以造成孕婦流產(chǎn)和胎兒畸型，并且是引起免疫功能缺陷患者死亡的重要病原體之一?，F(xiàn)有的抗弓形蟲藥物都存在副作用大、停藥后易復(fù)發(fā)等不足，目前臨床仍缺乏有效的治療藥物。頂質(zhì)體缺乏引起的“遲發(fā)型死亡”為弓形蟲病治療提供了一條新途徑，但其確切機(jī)制仍不完全清楚，難以應(yīng)用于臨床治療。因此，開展“遲發(fā)型死亡”機(jī)制研究對(duì)弓形蟲病的防治具有重要意義。
　　 方法：收集體外培養(yǎng)的弓形蟲RH株

2、速殖子并提取其RNA，RT-PCR法分別擴(kuò)增?；d體蛋白(ACP)和β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體acp/pET28和fabz/pET32，并在大腸桿菌rostta株表達(dá)。重組ACP和FABZ蛋白經(jīng)Ni-NTA親合純化柱純化，并免疫家兔制備多克隆抗體。以兔多克隆抗體Western blotting法檢測(cè)蟲體ACP和FABZ表達(dá)。
　　 收集體外培養(yǎng)的弓形蟲hxgprt-株速殖子并提取其DNA，PCR

3、法擴(kuò)增ACP蛋白基因，構(gòu)建弓形蟲轉(zhuǎn)染載體pHX-ACP-GFP，電穿孔法導(dǎo)入hxgprt-株速殖子，霉酚酸和黃嘌呤篩選ACP-GFP突變株。激光共聚焦顯微鏡觀察ACP-GFP融合蛋白在蟲體的分布，以兔抗GFP多克隆抗體Western blotting法檢測(cè)ACP-GFP蛋白的表達(dá)。
　　 人包皮成纖維(HFF)細(xì)胞中接種弓形蟲ACP-GFP突變株5×105個(gè)，24 h后在培養(yǎng)液中添加終濃度1 mM克林霉素誘導(dǎo)“遲發(fā)型死亡”，于2

4、 h、4 h和6 h收集蟲體。Real-time PCR法檢測(cè)蟲體ACP和GRA1蛋白編碼mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)ACP和GRA1蛋白表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察ACP-GFP融合蛋白在蟲體內(nèi)分布。
　　 收集體外培養(yǎng)TATi株速殖子并提取DNA，PCR法擴(kuò)增FABZ蛋白基因，構(gòu)建含有Ty標(biāo)簽的可誘導(dǎo)敲除載體pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR，電穿孔法導(dǎo)入TATi株，1μg/ml乙胺嘧啶篩

5、選可誘導(dǎo)敲除突變株，以Ty單克隆抗體Western blotting法檢測(cè)突變株FABZ-Ty融合蛋白表達(dá)。將該突變株接種HFF細(xì)胞，加入1μg/ml脫水四環(huán)素(ATc)啟動(dòng)可誘導(dǎo)敲除系統(tǒng)，于24 h和48 h時(shí)收集蟲體，Western blotting法檢測(cè)蟲體FABZ-Ty融合蛋白表達(dá)量。
　　 HFF細(xì)胞中接種四環(huán)素可誘導(dǎo)敲除突變株5×105個(gè)，同時(shí)加入1μg/mlATc啟動(dòng)可誘導(dǎo)敲除系統(tǒng)。分別于感染后2 h、4 h、8

6、h、12 h、24 h和48h收集蟲體，Real-time PCR法檢測(cè)不同時(shí)間FABZ蛋白編碼mRNA表達(dá)量以及蟲體uprt基因拷貝數(shù)，Giemsa染色法觀察不同時(shí)間HFF細(xì)胞內(nèi)速殖子/納蟲泡數(shù)量。
　　 結(jié)果：弓形蟲cDNA中分別擴(kuò)增出約550 bp和700 bp的ACP和FABZ蛋白編碼基因。PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和基因測(cè)序鑒定結(jié)果表明載體acp/pET28和fabz/pET32構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化大腸桿菌rostta株并成功

7、表達(dá)重組ACP和FABZ蛋白，經(jīng)Ni-NTA親合純化柱純化獲得純度較高的重組蛋白。制備的多克隆抗體可以分別檢測(cè)出蟲體ACP和FABZ蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽型及成熟型。
　　 弓形蟲基因組DNA中擴(kuò)增出約1300 bp的acp基因。PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和基因測(cè)序鑒定結(jié)果表明載體pHX-ACP-GFP構(gòu)建成功，可以用于蟲體轉(zhuǎn)染。蟲體經(jīng)1次電擊后仍有大量存活并可迅速進(jìn)入HeLa細(xì)胞，霉酚酸和黃嘌呤2～3天即可殺死未轉(zhuǎn)染蟲體。激光共聚焦顯微鏡

8、觀察到綠色熒光呈點(diǎn)狀聚集于項(xiàng)質(zhì)體，部分綠色熒光彌散地分布于蟲體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。兔抗GFP多克隆抗體Western blotting法可以識(shí)別出蟲體ACP蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽型(t-ACP)和成熟型(m-ACP)。
　　 1μM克林霉素作用2 h和4 h，蟲體ACP蛋白編碼mRNA表達(dá)量較對(duì)照組無顯著性差異；作用6 h，ACP蛋白編碼mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。Western blotting結(jié)果表明，克林霉素作用2 h，蟲體t-ACP和m-

9、ACP表達(dá)量與對(duì)照組無明顯差異；作用4 h，蟲體m-ACP表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，而t-ACP表達(dá)量無明顯變化；作用6 h后，蟲體t-ACP和m-ACP表達(dá)量均明顯降低。激光共聚焦顯微鏡觀察到克林霉素作用2h，蟲體內(nèi)同時(shí)存在著點(diǎn)狀綠色熒光和彌散成片的綠色熒光；作用4 h，點(diǎn)狀綠色熒光逐漸減少，彌散的綠色熒光變化不明顯；作用6 h，點(diǎn)狀綠色熒光基本消失，彌散的綠色熒光較2 h和4 h明顯減弱。
　　 TATi株蟲體基因組DNA中擴(kuò)

10、增出約800 bp產(chǎn)物。PCR法、限制性內(nèi)切酶酶切法和基因測(cè)序法鑒定pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR載體構(gòu)建成功。1μg/ml乙胺嘧啶2～3天即可殺死未轉(zhuǎn)染蟲體。Ty標(biāo)簽單克隆抗體Western blotting法檢測(cè)出蟲體轉(zhuǎn)運(yùn)肽型和成熟型FABZ-Ty融合蛋白。1μg/ml ATc啟動(dòng)四環(huán)素可誘導(dǎo)敲除系統(tǒng)，24 h和48 h均檢測(cè)出成熟型FABZ-Ty融合蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。
　　 ATc作用4 h，蟲

11、體FABZ蛋白編碼mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低；隨時(shí)間延長，ATc組蟲體FABZ蛋白編碼mRNA表達(dá)量進(jìn)一步減少，48 hFABZ蛋白編碼mRNA已降至極低水平。Giemsa染色法觀察，2 h、4 h和8 h ATc組和對(duì)照組HFF細(xì)胞內(nèi)速殖子數(shù)量未見明顯差異；12 h可見ATc組納蟲泡數(shù)量少于對(duì)照組，24 h對(duì)照組可見少量游離蟲體，但ATc組僅見納蟲泡數(shù)量增多。48 h對(duì)照組HFF細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量納蟲泡且部分細(xì)胞已被蟲體漲破，而ATc組僅

12、見納蟲泡數(shù)量增多。ATc作用2 h和4 h，Real-time PCR法檢出ATc組和對(duì)照組蟲體uprt基因拷貝數(shù)無顯著性差異；8 h和12 h，ATc組蟲體uprt基因拷貝數(shù)開始低于對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；24 h和48 h，ATc組蟲體uprt基因拷貝數(shù)明顯低于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：通過原核表達(dá)弓形蟲重組ACP和FABZ蛋白并制備其多克隆抗體，可以檢測(cè)出蟲體ACP和FABZ的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和成熟型，為頂質(zhì)體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)

13、。
　　 ACP蛋白可用于標(biāo)記頂質(zhì)體以及研究核基因組編碼的頂質(zhì)體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)方式。HXGPRT是一種較為理想的弓形蟲突變株篩選標(biāo)記，可以快速篩選出穩(wěn)定的弓形蟲突變株。通過突變株所帶附加標(biāo)簽，可以方便地檢測(cè)所需研究的蛋白，省去了制備多克隆抗體的繁瑣。
　　 克林霉素未直接影響弓形蟲核基因編碼的頂質(zhì)體蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，而是通過抑制頂質(zhì)體增殖，使蟲體內(nèi)頂質(zhì)體數(shù)量明顯減少，頂質(zhì)體蛋白無法經(jīng)頂質(zhì)體加工變?yōu)槌墒斓鞍装l(fā)揮生物學(xué)功能，導(dǎo)致頂