弓形蟲對DNA受體天然免疫通路的激活及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　弓形蟲能感染哺乳動物所有的有核細胞,全球約30％的人曾感染弓形蟲。天然免疫是抵抗弓形蟲感染的第一道防線,天然免疫細胞通過模式識別受體對弓形蟲的病原體相關(guān)分子模式進行識別和活化,分泌細胞因子和趨化因子從而清除弓形蟲感染;同時,弓形蟲也分泌毒力因子蛋白抑制天然免疫信號通路從而進行免疫逃逸。弓形蟲侵入宿主細胞后形成納蟲空泡,研究報道弓形蟲的納蟲空泡可在IFN-γ的作用下破裂,在宿主細胞質(zhì)中可檢測到弓形蟲的DNA。細胞質(zhì)中

2、出現(xiàn)的DNA是非常重要的危險信號,外源性的DNA或者自身DNA在胞質(zhì)內(nèi)的積累可觸發(fā)強烈的天然免疫反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的細胞因子,如IFN-β等。cGAS作為新發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì) DNA受體,通過激活 STING(干擾素基因刺激分子)、TBK1(TANK結(jié)合激酶1)、IRF3(干擾素調(diào)節(jié)因子3)誘導(dǎo)Ⅰ干擾素產(chǎn)生。基于以上研究背景,本實驗旨在研究弓形蟲納蟲空泡破裂后,其DNA進入宿主細胞質(zhì)中能否被DNA受體識別激活下游信號通路,誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生

3、以及對該通路的活化是否依賴于STING、cGAS和TBK1等關(guān)鍵基因,闡明弓形蟲感染的胞內(nèi)天然免疫機制,為理解胞內(nèi)病原體的天然免疫機制提供新內(nèi)容。
　　研究方法:
　　1.采用人包皮成纖維細胞(HFF)培養(yǎng)剛地弓形蟲 ME49-PTG株,抽提弓形蟲DNA。HEK293細胞轉(zhuǎn)染弓形蟲DNA,用熒光素酶報告基因技術(shù)檢測IFN-β、ISRE、NF-κB、AP-1基因的啟動子表達水平。
　　2.用穩(wěn)定表達ISRE熒光素酶報告基

4、因的2FTGH細胞測定I型干擾素的蛋白水平和生物活性。
　　3.采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡方法檢測轉(zhuǎn)錄因子IRF-3二聚體形成和活化。
　　4.通過過表達Sting、cGAS分析Sting和cGAS基因在弓形蟲DNA活化通路中的功能。
　　5.弓形蟲ME49-PTG株速殖子感染HEK293細胞,用熒光素酶報告基因技術(shù)檢測IFN-β、ISRE、NF-κB、AP-1基因的啟動子表達水平。
　　6.West

5、ern Blot鑒定TBK1基因敲除(TBK1-/-)和野生型TBK1+/+的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中 TBK1蛋白表達,并以弓形蟲速殖子感染 TBK1-/-和TBK1+/+MEF細胞,q-PCR檢測IL-6、IL-18、STING、ISG15、SAG1等細胞因子基因mRNA的轉(zhuǎn)錄變化,分析TBK1基因在弓形蟲激活天然免疫中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.HEK293細胞中IFN-β、ISRE啟動子的表達隨著轉(zhuǎn)染弓形

6、蟲DNA量的升高而升高。
　　2.I型干擾素生物活性實驗顯示:轉(zhuǎn)染弓形蟲DNA后,I型干擾素的生物活性顯著性增強,說明弓形蟲DNA可以誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生,并具有生物活性。
　　3.為進一步揭示弓形蟲DNA在感染宿主時的作用機制,我們檢測了IFN-β上游信號通路中轉(zhuǎn)錄因子IRF-3的活化情況,結(jié)果證明弓形蟲DNA可以使IRF-3發(fā)生二聚化,激活了IRF-3轉(zhuǎn)錄因子,說明弓形蟲DNA能夠通過IRF3激活I(lǐng)FN-β信號通路。

7、r>　　4.弓形蟲DNA轉(zhuǎn)染HEK293細胞,同時過表達cGAS和STING真核質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)IFN-β啟動子的表達量進一步升高,同時I型干擾素生物活性測定顯示IFNs活性增強,揭示弓形蟲DNA誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生可能通過cGAS-STING信號通路。
　　5.弓形蟲ME49-PTG株速殖子可以促進NF-κB啟動子的表達,揭示弓形蟲可能活化了NF-κB信號通路,而過表達cGAS-STING對NF-κB無影響,同時弓形蟲ME49-PTG

8、株速殖子可以輕微激活I(lǐng)FN-β,但對ISRE和AP-1影響不大。
　　6.Western Blot結(jié)果鑒定了在TBK1+/+MEF細胞中表達TBK1蛋白,而在TBK1基因敲除的MEF細胞(TBK1-/-)中TBK1蛋白不表達。用弓形蟲速殖子感染TBK1+/+MEF細胞和TBK1-/-MEF細胞,q-PCR結(jié)果顯示,弓形蟲內(nèi)參基因表面抗原蛋白1(SAG1)mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨著時間的增加而升高,說明在小鼠胚胎成纖維細胞中弓形蟲的感染和

9、增殖情況;同時,弓形蟲速殖子可以抑制IL-6、IL-18、ISG15、STING的mRNA轉(zhuǎn)錄。在TBK1-/-細胞感染弓形蟲的結(jié)果中發(fā)現(xiàn),TBK1基因敲除后,ISG15和IL-18的mRNA水平顯著下降;IL-6的mRNA水平有所升高。
　　結(jié)論:
　　1.弓形蟲DNA能夠激活I(lǐng)RF3,使其二聚化,誘導(dǎo) IFN-β的產(chǎn)生,進而促進ISRE的表達,該激活途徑有可能通過cGAS-STING信號通路。
　　2.弓形蟲速殖子