弓形蟲(chóng)抗原調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)是一種頂復(fù)門(mén)專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，是非常重要的人獸共患病原體。弓形蟲(chóng)生活史復(fù)雜，宿主范圍廣泛，能感染包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游铩９蜗x(chóng)一直作為了解宿主免疫系統(tǒng)抵抗細(xì)胞內(nèi)病原體的重要的模式生物。NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為在調(diào)節(jié)對(duì)抗弓形蟲(chóng)的宿主初級(jí)和獲得性免疫反應(yīng)中有著重要的地位。近年來(lái)，一系列弓形蟲(chóng)抗原被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控宿主NF-κB信號(hào)通路，但它們的具體機(jī)制尚不明確。
　　本研究首先檢測(cè)5株不同弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)宿主NF-κB信號(hào)

2、通路的影響;然后利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了22種弓形蟲(chóng)抗原對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)GRA15能激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)其激活通路的具體分子機(jī)制進(jìn)行了探索。
　　1)不同株弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響
　　將RH、Me49、VEG、地方Ⅰ型和地方Ⅱ型弓形蟲(chóng)速殖子感染HEK293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)它們不同感染豐度下對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)Me49、VEG、地方Ⅰ型和地方Ⅱ型弓

3、形蟲(chóng)能激活NF-κB信號(hào)通路，RH株弓形蟲(chóng)對(duì)NF-κB信號(hào)通路有非常明顯的抑制效應(yīng)。
　　利用間接免疫熒光試驗(yàn)評(píng)估5種弓形蟲(chóng)速殖子入侵細(xì)胞的能力，選取有相似入侵量時(shí)的感染豐度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響存在差異。
　　2)激活NF-κB信號(hào)通路的弓形蟲(chóng)抗原的篩選
　　將22種弓形蟲(chóng)抗原真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅有pCMV-GRA15(Ⅱ)和pCMV-

4、GRA15(Ⅰ)能夠激活NF-κB信號(hào)通路。
　　利用Western blot和IFA分析表達(dá)了Ⅰ型GRA15蛋白的宿主細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p65磷酸化水平顯著提高，并發(fā)生核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，驗(yàn)證了Ⅰ型GRA15能夠激活NF-κB信號(hào)通路。
　　3) GRA15激活NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制
　　根據(jù)生物信息學(xué)分析，全長(zhǎng)的GRA15存在著兩種結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)和核定位信號(hào)。因此構(gòu)建了7個(gè)不同長(zhǎng)度的GRA15截短真核表達(dá)質(zhì)粒(pCMV

5、-GRA15-1、pCMV-GRA15-2、pCMV-GRA15-3、 pCMV-GRA15-4、 pCMV-GRA15-5、pCMV-GRA15-6和pCMV-GRA15-7)，將它們分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)到pCMV-GRA15-4、pCMV-GRA15-5、pCMV-GRA15-6和pCMV-GRA15-7均有激活NF-κB信號(hào)通路的作用，推測(cè)Ⅰ型GRA15的194-518氨基酸區(qū)域?yàn)榧せ頝F-κB信