弓形蟲C-18、MIC11、PI等體內(nèi)外差異表達(dá)基因?qū)F-κB信號通路的影響.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii）是一種世界范圍廣泛寄生于人和多種脊椎動物有核細(xì)胞中的機會性致病原蟲。弓形蟲能夠感染人、豬、牛、馬、羊和鹿等動物，導(dǎo)致孕婦或母畜流產(chǎn)、死胎、畸胎和弱智兒，對人類的生命健康和畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的威脅。鑒于弓形蟲的高度感染率及其在人體醫(yī)學(xué)和畜牧醫(yī)學(xué)中的重要性，探究弓形蟲的致病機理和研制安全有效的疫苗顯得極其重要，這也是預(yù)防和控制人類和動物弓形蟲病的重要措施。
　　為此，本研究用RH株弓形蟲

2、速殖子感染293T細(xì)胞，驗證RH株弓形蟲速殖子對293T細(xì)胞NF-κB信號通路的激活與抑制;通過實時熒光定量PCR(real-timePCR)驗證4個體內(nèi)誘導(dǎo)抗原假定蛋白基因體內(nèi)外表達(dá)的差異;并將其與已經(jīng)驗證過的3個體內(nèi)外誘導(dǎo)抗原功能基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，探索這些重組質(zhì)粒對293T細(xì)胞中NF-κB信號通路的激活與抑制;以弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因JK483877、JK483898構(gòu)建DNA疫苗，并在BALB/c小鼠中檢測該疫苗的免疫保護(hù)性。

3、
　　(1)弓形蟲速殖子全蟲對293T細(xì)胞的NF-κB信號通路影響
　　收集純化過的RH株弓形蟲速殖子并接種293T細(xì)胞，根據(jù)雙熒光數(shù)值分析，RH株弓形蟲速殖子能夠顯著的激活293T細(xì)胞中的NF-κB信號通路;收集純化過的RH株弓形蟲速殖子接種293T細(xì)胞，用TNF-α刺激細(xì)胞，根據(jù)雙熒光數(shù)值分析，RH株弓形蟲速殖子不能夠抑制由TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的活化，隨著RH株速殖子接種比例增加，激活該通路的倍數(shù)持續(xù)增加。

4、　　(2)通過real-timePCR驗證體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因的體內(nèi)外差異表達(dá)
　　針對體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因JK483877、JK483880、JK483881、JK483898序列，設(shè)計引物，通過real-timePCR驗證了在體內(nèi)條件下速殖子感染BALB/c小鼠72h和體外條件下BHK細(xì)胞培養(yǎng)弓形蟲速殖子72h后，4個體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因在宿主體內(nèi)表達(dá)量均高于體外表達(dá)量，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著(P＜0.05)。
　　(3)構(gòu)建體內(nèi)誘導(dǎo)

5、抗原基因真核表達(dá)質(zhì)粒
　　將上述4個體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因和功能基因C-18、MIC11、PI一起構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，設(shè)計針對該7個基因的全長引物，通過PCR擴增出目的片段，連接到克隆載體pMD19-T中鑒定正確后再連接到真核表達(dá)載體PCMV-Tag2B上，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　(4)驗證構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒對293T細(xì)胞的NF-κB信號通路影響
　　將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，根據(jù)雙熒光數(shù)值分析，所構(gòu)建的7個體內(nèi)誘導(dǎo)抗原

6、真核表達(dá)質(zhì)粒均不能激活293T細(xì)胞的NF-κB信號通路，也不能夠抑制293T細(xì)胞的NF-κB信號通路，雖然有幾個體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因有抑制的趨勢，但是趨勢不是很明顯，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(5)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原JK483877、JK483898免疫原性研究
　　通過間接免疫熒光(IFA)證明重組表達(dá)質(zhì)粒能夠被弓形蟲兔多克隆抗血清特異性識別，具有較好的抗原性。利用TLA-ELISA未在實驗組的免疫鼠血清中檢測到特異性的TLA抗體，與

7、對照組無明顯差異;通過細(xì)胞因子ELISA實驗，未見實驗組小鼠產(chǎn)生高水平的IL-2、IL-4、IL-12及IFN-γ;淋巴細(xì)胞增殖實驗中，實驗組鼠淋巴細(xì)胞相對于空載體組和PBS組并未見顯著的增殖;小鼠腹腔接種RH株弓形蟲速殖子，空載體組小鼠于在8天內(nèi)全部死亡，兩組疫苗組小鼠在攻蟲15天后均有1只小鼠存活，但是PBS組仍有2只小鼠存活。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的DNA疫苗沒有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性弓形蟲抗體，不具有保護(hù)力。
　　本研究通過驗證構(gòu)