NF-κB信號通路對腦出血后自噬及細胞死亡的影響.pdf

1、目的：研究腦出血后自噬相關蛋白表達規(guī)律、研究阻斷NF-κB信號通路對腦出血后自噬激活及細胞質膜完整性破壞的影響,并對其調節(jié)機制進行初步探討。
　　 方法：體內試驗。采用紋狀體部位注射膠原酶Ⅳ法建立小鼠腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)模型,建立模型前5 min分別側腦室注射SN50(NF-κB的特異性抑制劑,0.1μg/1μ1)或等體積生理鹽水,腦出血對照組不做任何預處理直接建立模型,同時設立空白

2、對照組。各組按出血后時間不同分為出血后1 h,6 h,24 h,48 h和7 d組,各組分別于處死前1 h用腹腔注射法將碘化丙啶(propidium iodide,PI)注入各組小鼠體內,采用體視學顯微鏡分別計數各組出血中央區(qū)及出血周邊區(qū)PI陽性細胞數,研究腦出血后細胞質膜完整性破壞的變化規(guī)律以及阻斷NF-κB對腦出血引起的細胞質膜完整性破壞的影響；采用Motor Test評估腦出血后各組動物的運動功能；運用Western blot法和

3、免疫組織熒光法觀察腦出血后各組腦組織中自噬相關蛋白LC3,Bcl-2,Beclin-1的表達情況。體外實驗:體外培養(yǎng)PC12細胞。傳代時將細胞分為三組：一組培養(yǎng)基中加入Hemin,一組培養(yǎng)基中加入Hemin的同時加入SN50,各組于24 h、48 h后終止培養(yǎng),收集細胞。同時設立空白對照組。Western blot檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin-1、Bcl-2的表達情況。
　　 結果：與正常小鼠相比,腦出血后PI陽性細胞數

4、隨時間變化逐漸增多,其中出血中央區(qū)陽性細胞數高峰出現在48 h時、出血周邊區(qū)24 h時達高峰。至7 d時細胞死亡數目達穩(wěn)定(均P<0.05)。免疫印記實驗結果顯示腦出血后Beclin-1蛋白表達增多,Bcl-2蛋白表達下降,但Beclin-1/Bcl-2比值升高；LC3蛋白表達顯著增加(均P<0.05)；與鹽水處理組相比,SN50處理組小鼠腦出血后出血周邊區(qū)PI陽性細胞數目無明顯減少,出血中央區(qū)PI陽性細胞24 h-48 h時顯著減少(

5、P<0.05),至7 d時已無明顯減少。行為學實驗結果顯示:與鹽水處理組相比,SN50處理組腦出血后運動功能無明顯改善,免疫印記實驗結果顯示SN50促進了Beclin-1表達的增加,Bcl-2蛋白表達先下降后升高,Beclin-1/Bcl-2比值升高,增強了腦出血誘導的LC3表達的激活(均P<0.05)；PC12細胞免疫印記實驗結果顯示:SN50促進了Hemin誘導的LC3的表達上調；促進了Beclin-1表達的上調,逆轉了Hemin誘

6、導的Bcl-2的下調,Beclin-1/Bcl-2比值增加(均P<0.05)。
　　 結論：腦出血可以造成細胞質膜完整性破壞,腦出血后24 h～48 h質膜完整性遭破壞的細胞數量達高峰,表現為PI陽性細胞顯著增多；SN50可以暫時緩解腦出血造成的出血中央區(qū)的細胞質膜完整性破壞,但對延遲性的細胞死亡無明顯作用。腦出血后自噬被激活,自噬部分參與了腦出血引起的細胞死亡；SN50能夠促進腦出血后自噬的激活,這種激活至少部分通過Becli