干預(yù)NF-κB信號通路對劃痕損傷后神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的：通過神經(jīng)元的體外培養(yǎng)、藥物干預(yù)及建立劃痕損傷模型，研究干預(yù)NF-κB這單一因素對神經(jīng)元壞死、凋亡和自噬的影響，進(jìn)一步闡明NF-κB在創(chuàng)傷性腦損傷后的作用機(jī)制，為臨床治療及改善創(chuàng)傷性腦損傷預(yù)后提供新思路。
　　 方法：取新生SD大鼠的大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)7天至神經(jīng)元成熟后，利用光鏡和細(xì)胞免疫熒光對培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定;應(yīng)用20uL微量移液器槍頭劃割細(xì)胞，造成體外培養(yǎng)神經(jīng)元的機(jī)械性損傷;然后將每批細(xì)胞分

2、為空白組、激活組、抑制組、劃痕組、劃痕+激活組和劃痕+抑制組，共6組，各組細(xì)胞予相應(yīng)處理后，分別在1h、6h、12h、24h、48h時，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)檢測神經(jīng)元磷酸化NF-κB p65的表達(dá)情況，應(yīng)用流式細(xì)胞法檢測神經(jīng)元的凋亡和壞死情況，應(yīng)用Western blot檢測自噬蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：⑴神經(jīng)元的培養(yǎng):神經(jīng)元細(xì)胞體外培養(yǎng)7天成熟后，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞免疫熒光染色神經(jīng)元細(xì)胞陽性率達(dá)90

3、％以上。⑵損傷模型的建立:機(jī)械劃割后見神經(jīng)元不同程度的損傷，劃傷區(qū)域神經(jīng)元胞體及突起結(jié)構(gòu)完全消失，見較多細(xì)胞碎片，劃傷區(qū)周圍神經(jīng)元突起斷裂退縮，遠(yuǎn)隔部位結(jié)構(gòu)無明顯改變。隨著損傷時間的延長，損傷區(qū)周圍部分神經(jīng)元胞質(zhì)透亮度降低，有的胞膜破裂，胞體及突起結(jié)構(gòu)崩解，漂浮細(xì)胞增多。⑶磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測:激活組、劃痕組、劃痕+激活組及劃痕+抑制組的NF-κ B p65蛋白隨著作用時間的延長表達(dá)增加，抑制組的NF-κ B p65表

4、達(dá)稍升高。激活組、劃痕組和劃痕+激活組，6h時NF-κB p65的表達(dá)均開始明顯增大，劃痕組24h時表達(dá)最多，與空白組比較6h起均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);劃痕+激活組24h時表達(dá)量最多，與對照組和劃痕組比較6h起均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與激活組比較6h后有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);劃痕+抑制組的NF-κB p65在12h起表達(dá)增加，與對照組和抑制組比較6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與劃痕組比

5、較，NF-κB p65表達(dá)減少，6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑷凋亡和壞死的檢測:劃痕損傷后神經(jīng)元有不同程度的凋亡和壞死，壞死明顯晚于凋亡發(fā)生。劃痕組細(xì)胞6h開始出現(xiàn)凋亡，24h到達(dá)高峰，壞死出現(xiàn)較晚，在12h時明顯出現(xiàn)，48h達(dá)高峰，與空白組的凋亡和壞死比較6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);劃痕+激活組神經(jīng)元細(xì)胞6h時凋亡和壞死同時出現(xiàn)，凋亡占的比例稍高，24h時凋亡達(dá)高峰，12h～24h時壞死達(dá)高峰，與劃痕組比較

6、6h起均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與激活組比較6h以后均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);劃痕+抑制組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和壞死出現(xiàn)稍晚，12h時開始出現(xiàn)，24h～48h達(dá)到高峰，與劃痕組比較凋亡和壞死率低，6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與抑制組比較6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑸自噬的檢測:劃痕損傷后神經(jīng)元出現(xiàn)了自噬現(xiàn)象，劃痕組LC3Ⅱ蛋白6h時表達(dá)開始增加，24h～48h達(dá)高峰，與對照組比較6h起有顯著的統(tǒng)計

7、學(xué)意義(P＜0.05);劃痕+激活組LC3Ⅱ蛋白6h表達(dá)明顯增加，24h達(dá)高峰，與劃痕組和激活組比較，6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);劃痕+抑制組的LC3Ⅱ蛋白在12h以后表達(dá)增加，與劃痕組和抑制組比較6h起有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：體外培養(yǎng)的新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元純度較高，劃痕損傷對神經(jīng)元有致傷作用。劃痕損傷后磷酸化NF-κB p65蛋白表達(dá)增加，24h時達(dá)高峰，PMA和PDTC對損傷后神經(jīng)元