漢黃芩素對脂多糖誘導的脊髓背根神經(jīng)元炎癥反應中MAPK-NF-κB信號通路的影響.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)性疼痛是一組由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能障礙引起的慢性疼痛綜合征，臨床上病人常有自發(fā)疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏等不適，嚴重影響病人的生活質(zhì)量。目前治療神經(jīng)性疼痛的藥物臨床治療效果不佳且副作用明顯，因此，從天然藥物中尋找有效的神經(jīng)性疼痛的治療，或許能為此類治療提供新的途徑。漢黃芩素（Wogonin）作為天然的黃芩黃酮類化合物，已證明在治療炎癥疾病方面有益，但對于脊髓背根（Dorsal root ganglion，DRG）

2、神經(jīng)元中的神經(jīng)炎性疼痛的干預尚未有研究。本實驗首先分離大鼠 DRG神經(jīng)元，建立脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導的DRG神經(jīng)元炎癥反應模型，確定LPS溶液的最佳濃度和作用時間，進而通過漢黃芩素處理，體外觀察其對TLR4表達（TLR4 mRNA和TLR4蛋白水平）及下游通路（TLR4下游銜接分子MyD88、TAK1水平）的影響，并進一步探討漢黃芩素對下游MAPK和NF-κB信號通路及重要炎癥因子的影響，為臨床治療

3、神經(jīng)炎性疼痛提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.選用健康雄性Wistar大鼠，擊后腦致昏后，斷頭處死，取胸段脊柱，急性分離DRG神經(jīng)元后培養(yǎng)和純化，用LDS構建神經(jīng)炎性反應模型，RT-qPCR檢測DRG神經(jīng)元中TLR4 mRNA的表達量，確定最佳濃度和作用時間。
　　2. LPS誘導DRG神經(jīng)元炎性反應后，不同濃度漢黃芩素處理，并設VIPER做陽性對照以及未做任何處理的DRG神經(jīng)元做陰性對照，分別用RT-qPCR、

4、western blot檢測DRG神經(jīng)元中TLR4 mRNA和TLR4蛋白的變化情況，確定最佳濃度。
　　3. LPS誘導DRG神經(jīng)元炎性反應，適宜濃度漢黃芩素處理，并設VIPER做陽性對照以及未做任何處理的DRG神經(jīng)元做陰性對照，Western blot檢測DRG神經(jīng)元中MyD88和TAK1的變化情況；CO-IP檢測TLR4與MyD88和TAK1配體的關聯(lián)；western blot檢測NK/p-JNK、ERK1/2/p-ERK1

5、/2和p38/p-p38蛋白的變化情況；RT-qPCR檢測NF-κB p65 DNA和western blot檢測IκK/p-IκK；ELISA檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和western blot檢測COX-2、iNOS的變化情況。
　　結果：
　　1、在體外條件下，LPS能誘導成功構建DRG神經(jīng)元的炎癥損傷模型。在DRG神經(jīng)元中，LPS誘導的TLR4 mRNA的表達有濃度和時間依賴性，隨著濃度的增加，DR

6、G神經(jīng)元上的TLR4 mRNA的表達量逐漸上升，在LPS為10ng/ml的溶液中TLR4 mRNA的表達量最大；隨著培養(yǎng)時間的延長，DRG神經(jīng)元中的TLR4 mRNA表達量逐漸增加，在LPS為10ng/ml的溶液中培養(yǎng)時間為90min時TLR4 mRNA表達量最大。
　　2、不同劑量漢黃芩素對TLR表達4的影響：LPS能誘導DRG神經(jīng)元中TLR4 mRNA、TLR4蛋白的表達，而予漢黃芩素處理后，TLR4 mRNA和TLR4蛋白的

7、表達均降低，且當漢黃芩素為25μM時，DRG神經(jīng)元中的TLR4 mRNA表達最低，低于VIPER組，差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；當漢黃芩素為100μM時，DRG神經(jīng)元中的TLR4蛋白表達量最低，但與VIPER組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明漢黃芩素可以部分減弱LPS誘導的TLR4 mRNA和TLR4蛋白表達，且具有濃度依賴性。
　　3、漢黃芩素對TLR4-MyD88-TAK1信號通路的影響：與CT組相比，LPS組

8、給予內(nèi)毒素刺激DRG神經(jīng)元后TLR4 mRNA和TLR4、MyD88和p-TAK1表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與LPS組相比，漢黃芩素與VIPER處理后TLR4 mRNA、TLR4、MyD88和p-TAK1蛋白的表達明顯降低（P＜0.05），但二者使其下降的程度組間比較均無明顯的統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　與CT組相比，LDS刺激DRG神經(jīng)元后能引起TLR4/MyD88和TLR4/TAK1復合物的顯著增加

9、（P＜0.05）；而予以漢黃芩素和VIPER處理后，相比于LSD組，兩種復合物均明顯減少（P＜0.05）；但二者使二種復合物增加的程度均無無明顯的統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。同樣的，反向共免疫使用MyD88抗體檢測TLR4/MyD88復合物，漢黃芩素組和VIPER組TLR4表達也較LPS誘導組明顯降低（P＜0.05）。說明漢黃芩素能夠顯著降低LPS誘導的DRG神經(jīng)元炎性反應中TLR4與MyD88和TAK1的相互作用，減輕炎癥反應。

10、>　　4、漢黃芩素對MAPK信號通路的影響：與CT組相比，LPS刺激DRG神經(jīng)元后可使NK/p-JNK、ERK1/2/p-ERK1/2和p38/p-p38蛋白表達量均顯著增加（P＜0.05）。而予以漢黃芩素和VIPER處理后，相比于LSD組，p-JNK、p-ERK1/2和p-p38蛋白表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但二者對三種蛋白磷酸化的降低程度組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明漢黃芩素與VIPER一樣，

11、能夠明顯降低JNK、ERK1/2和p38蛋白的活性，抑制LPS誘導的DRG神經(jīng)元炎性反應中MAPK信號通路。
　　5、漢黃芩素對NF-κB信號通路的影響：與CT組相比，LPS組DRG神經(jīng)元中的NF-κB p65DNA、p-IκK表達量明顯增加，而IκK的表達量明顯降低（P＜0.05)；與LPS組相比，漢黃芩素和VIPER能明顯減少DRG神經(jīng)元中的NF-κB p65 DNA和p-IκK表達量，而IκK的表達量則明顯降低（P＜0.05

12、)；但漢黃芩素組與VIPERL組的NF-κB p65DNA、IκK、p-IκK表達量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。說明漢黃芩素降低 LDS誘導的DRG神經(jīng)元炎性反應中NF-κB的活性，減弱NF-κB介導的信號通路的作用。
　　6、漢黃芩素對炎癥因子的影響：與CT組相比，LPS組DRG神經(jīng)元中的IL-1β、TNF-α、L-6、COX-2和iNOS表達量明顯增加（P＜0.05)；與LPS組相比，漢黃芩素和VIPER能明顯

13、減少DRG神經(jīng)元中的IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS表達量（P＜0.05)；但漢黃芩素組與VIPERL組的五種炎癥因子的表達量組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。說明漢黃芩素能顯著抑制LPS誘導的DRG神經(jīng)元炎性反應中重要炎癥因子的表達，具有抗炎作用。
　　結論：
　　在LPS誘導的DRG神經(jīng)元炎癥反應中，漢黃芩素通過抑制TLR4-MyD88-TAK1信號通路中的關鍵信號銜接蛋白MyD88和T