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文檔簡介
1、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是選擇性侵犯上、下運動神經(jīng)元的慢性進行性變性疾病。目前ALS的病因及發(fā)病機制尚不十分清楚,推測有以下幾種:線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)異常聚集、興奮毒作用、軸漿運輸障礙、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏和炎癥等。各種發(fā)病因素并非獨立存在,而是相互作用、相互影響,共同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來越來越多的證據(jù)顯示,運動神經(jīng)元的選擇性丟失并非細胞自主性的(non-cell-autonomous),膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)及炎癥反應(yīng)在ALS
2、的疾病進程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 脊髓器官型培養(yǎng)保留有完整的脊髓水平組織結(jié)構(gòu)和細胞間突觸聯(lián)系,較單細胞培養(yǎng)更接近在體生理環(huán)境,且運動神經(jīng)元能夠穩(wěn)定存活較長時間,為研究ALS等慢性疾病提供了重要的技術(shù)手段。脂多糖(LPS)通過Toll樣受體,激活機體的天然免疫系統(tǒng)(在CNS主要是小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞),引起炎癥反應(yīng)。因此本研究應(yīng)用LPS,利用器官型脊髓薄片培養(yǎng)技術(shù)建立了炎癥介導(dǎo)的運動神經(jīng)元損傷的體外模型,并以此模型為基礎(chǔ),深入探討
3、了運動神經(jīng)元的損傷機制。課題研究分三部分:第一部分利用脊髓器官型培養(yǎng),加入合適濃度的LPS,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),建立運動神經(jīng)元相對選擇性受損的體外培養(yǎng)模型,并對運動神經(jīng)元的易受損性進行了分析;第二部分以此模型為基礎(chǔ),利用RT-PCR、免疫印跡等方法,研究了NADPH氧化酶在其中的變化規(guī)律,并應(yīng)用相應(yīng)的抑制劑apocynin證實了NADPH氧化酶在LPS誘導(dǎo)的運動神經(jīng)元損傷中的關(guān)鍵作用;第三部分利用分子生物學(xué)等技術(shù),證實LPS干預(yù)后可引起該培養(yǎng)
4、體系中誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和神經(jīng)型NOS(nNOS)活性增加、NO生成增多,進一步應(yīng)用NOS選擇性和非選擇性抑制劑均未能有效對抗運動神經(jīng)元損傷,提示在該模型體系中,NO可能并未對運動神經(jīng)元損傷起著決定性作用。 一、脂多糖誘導(dǎo)的脊髓前角運動神經(jīng)元損傷及其易感性研究 目的:利用脊髓器官型培養(yǎng),觀察LPS能否誘導(dǎo)該體系炎癥反應(yīng)的發(fā)生,尋找合適的劑量建立運動神經(jīng)元相對選擇性受損的體外培養(yǎng)模型,探討運動神經(jīng)元易感性的可能原因。
5、 方法:選用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓組織切片進行體外培養(yǎng),正常培養(yǎng)1周后,進行干預(yù)。對照組為單純培養(yǎng)液,LPS組加入不同濃度的LPS(1、10、30、60 μg/ml),應(yīng)用SMI-32和calretinin免疫組化染色對培養(yǎng)后2、3、4周時的脊髓薄片腹角運動神經(jīng)元和背角中間神經(jīng)元進行計數(shù),透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化,測定各時點培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量,利用RT-PCR技術(shù)觀察LPS處理后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、
6、白介素-1β(L-1β)mRNA表達水平。選取30 μg/ml LPS處理2周作為進行藥物干預(yù)實驗的劑量和時間。脊髓片體外培養(yǎng)1周后,分別給予單純培養(yǎng)液、LPS(30 μg/ml)、細胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM(10 μmol/L)加LPS(30μg/ml),干預(yù)2周后用免疫組化方法顯示運動神經(jīng)元,計數(shù)各組運動神經(jīng)元數(shù)量。 結(jié)果:(1)正常對照組脊髓薄片在體外存活良好,運動神經(jīng)元數(shù)目恒定,1μg/ml LPS組各時點運動神
7、經(jīng)元數(shù)量無顯著變化(P>0.05),10μg/mlLPS組運動神經(jīng)元數(shù)量隨時間延長而逐漸減少,處理3周后與對照組比較有顯著性差異(P<0.05),而30、60μg/ml LPS組分別在處理2周和1周后出現(xiàn)運動神經(jīng)元數(shù)量的減少(P<0.05,P<0.01)。(2)1、10、30 μg/ml LPS處理1~3周以及60 μg/ml LPS處理2周內(nèi)背角中間神經(jīng)元數(shù)量與對照組相比無顯著變化(P>0.05),60 μg/ml LPS處理3周后中
8、間神經(jīng)元數(shù)量開始減少(P<0.05)。(3)10μg/ml LPS處理3周后出現(xiàn)LDH含量增高(P<0.05),而30、60 μg/ml LPS組LDH在LPS處理2周后即開始增高,與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。(4)透射電鏡觀察,對照組神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)基本正常;30 μg/ml LPS處理2周后,超微結(jié)構(gòu)顯示腹角運動神經(jīng)元空泡變性,線粒體腫脹、嵴斷裂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體擴張,脊髓背角中間神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變不明顯,小膠質(zhì)細
9、胞體積明顯增大,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量的脂滴和膜性小體。(5)30、60 μg/ml LPS處理1天后,TNF-α mRNA水平較對照組明顯增高(P<0.05,P<0.01);處理3天后,IL-1β表達水平也明顯升高(P<0.01)。(6)脊髓薄片體外培養(yǎng)1周后,同時應(yīng)用10 μmol/L BAPTA-AM和30 μg/ml LPS進行干預(yù),與LPS組相比,運動神經(jīng)元存活數(shù)量明顯增加(P<0.01),胞體形態(tài)規(guī)則,突起增多。 結(jié)論:在體
10、外脊髓器官型培養(yǎng)體系中加入LPS,可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),引起劑量和時間依賴性的運動神經(jīng)元數(shù)量減少和培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶含量增高。30μg/ml LPS作用2周后,可引起SMI-32陽性運動神經(jīng)元減少,超微結(jié)構(gòu)改變,而并不明顯影響中間神經(jīng)元的存活,與ALS的病理特點相一致,可用于制備ALS的脊髓器官型培養(yǎng)模型。運動神經(jīng)元缺乏鈣網(wǎng)膜蛋白表達,而細胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM減輕運動神經(jīng)元損傷,提示鈣離子緩沖能力較低是其較易受損的原因之一。該模
11、型的建立,為后續(xù)研究ALS的發(fā)病機制、探索新的治療策略提供了實驗基礎(chǔ)。 二、NADPH氧化酶參與脂多糖誘導(dǎo)的運動神經(jīng)元損傷 目的:利用LPS誘導(dǎo)的運動神經(jīng)元相對選擇性受損的脊髓器官型培養(yǎng)模型,研究NADPH氧化酶在其中的變化規(guī)律,并應(yīng)用相應(yīng)的抑制劑反證其作用,以期闡明炎癥過程中運動神經(jīng)元受損的關(guān)鍵機制,從而為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。 方法:選用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓組織切片進行體外培養(yǎng),正常培養(yǎng)1周后,
12、分別給予單純培養(yǎng)液、LPS(30μg/ml)、NADPH氧化酶抑制劑apocynin(0.5、1mmol/L)加LPS(30μg/ml),干預(yù)2周后,用SMI-32免疫組化染色對運動神經(jīng)元進行鑒定、計數(shù)。利用RT-PCR、Western blot等方法,檢測NADPH氧化酶亞基gp91phox和p47phox mRNA水平、蛋白含量的變化,并測定各組脊髓薄片組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量和培養(yǎng)液中LDH含量。 結(jié)論:器
13、官型脊髓培養(yǎng)組織經(jīng)LPS處理后,胞膜中p47phox含量明顯增加,NADPH氧化酶活性增高。給予apocynin干預(yù),可以抑制p47phox亞基從胞漿轉(zhuǎn)位到胞膜,從而抑制NADPH王氧化酶激活,進而產(chǎn)生保護運動神經(jīng)元的作用,培養(yǎng)液中LDH含量和脊髓薄片組織中MDA含量也較LPS組明顯下降,從不同角度證實了apocynin的有益作用。本研究證實了NADPH氧化酶在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的運動神經(jīng)元損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,為ALS的治療提供
14、新策略。 三、一氧化氮在脂多糖誘導(dǎo)的脊髓前角運動神經(jīng)元損傷中的作用 目的:在脊髓器官型培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上,觀察LPS干預(yù)后iNOS和nNOS的表達情況、酶活力變化以及NO水平的改變,并應(yīng)用NOS相應(yīng)的選擇性或非選擇性抑制劑,探討NO在炎癥介導(dǎo)的運動神經(jīng)元損傷中的確切作用。 方法:選用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓組織切片進行體外培養(yǎng),正常培養(yǎng)1周后,分別給予單純培養(yǎng)液、LPS(30或60μg/ml),處理3天或2周后,
15、收集脊髓薄片組織,檢測各組NOS mRNA水平和酶活性改變;并留取處理3天、1周、2周后培養(yǎng)液,測定NO含量變化。藥物干預(yù)實驗時LPS濃度選用30μg/ml,分為以下幾組:對照組、LPS組、iNOS選擇性抑制劑1400W或AG加LPS組、nNOS選擇性抑制劑7-NI加LPS組、NOS非選擇性抑制劑L-NAME加LPS組,測定干預(yù)后3天、1周、2周后培養(yǎng)液中NO含量,并應(yīng)用SMI-32免疫組化染色對運動神經(jīng)元進行鑒定、計數(shù)。 結(jié)論
16、:LPS在脊髓器官型培養(yǎng)體系中可以誘導(dǎo)iNOS mRNA水平和酶活力升高、nNOS活性增加以及NO生成增多,但應(yīng)用iNOS抑制劑1400W和AG、nNOS抑制劑7-NI、NOS非選擇性抑制劑L-NAME均未證實NO在該培養(yǎng)體系中對介導(dǎo)運動神經(jīng)元損傷具有關(guān)鍵作用,單純抑制NO生成并不能明顯改善運動神經(jīng)元的存活。鑒于NO來源于三種不同的NOS及其自身作用的雙重性,在疾病的不同階段調(diào)控不同來源NO的生成量比單純抑制NO生成將可能具有更好的治療
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