脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立.pdf

1、失神經(jīng)喉肌等骨骼肌的再生和功能重建是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)，而神經(jīng)肌肉接頭重建和成肌干細(xì)胞分化融合修復(fù)受損肌纖維是失神經(jīng)骨骼肌再生和功能恢復(fù)的關(guān)鍵。因此，為了更好的研究失神經(jīng)喉肌等骨骼肌的再生機(jī)制，從而為干預(yù)神經(jīng)肌肉再生關(guān)鍵分子事件提供新的治療策略和理論依據(jù)，建立一個(gè)適當(dāng)?shù)捏w外模型顯得至關(guān)重要。而脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)就是其中的關(guān)鍵技術(shù)之一。
　　 目前，大部分已知的神經(jīng)肌肉體外共培養(yǎng)模型均采用含血清培養(yǎng)基，這為體外神經(jīng)肌

2、肉接頭的形成提供了一個(gè)功能性的模型系統(tǒng)，但血清的使用也增加了不必要的變異性，由于使用血清使重復(fù)體外神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)體系時(shí)描述和量化所需的最低因素變得不可能，因此，也有人設(shè)計(jì)了新型的無血清培養(yǎng)技術(shù)用于神經(jīng)肌肉共培養(yǎng)，以促進(jìn)功能性的神經(jīng)肌肉接頭的形成。
　　 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及骨骼肌細(xì)胞的取材也不盡相同，而其中培養(yǎng)體外分離的胚胎神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞便利了對(duì)脊椎動(dòng)物神經(jīng)肌肉接頭發(fā)展過程的分析，復(fù)制組織型的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用往往很難達(dá)到分離

3、胚胎干細(xì)胞所能達(dá)到的效果。從脊髓外植體獲得的胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或者軸突與骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)，容易形成功能性的突觸，可以達(dá)到很高程度的結(jié)構(gòu)和功能的分化。目前，對(duì)體外神經(jīng)肌肉突觸形成中分離細(xì)胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)取得了一些關(guān)鍵性的成果。
　　 在過去的研究中，Chen等采用NG108-15/C2C12共培養(yǎng)模型用來測(cè)定肌管上形成的作為神經(jīng)肌肉接頭形成最早的標(biāo)記物乙酰膽堿受體(AchR)簇集。雖然NG108-15細(xì)胞可以長(zhǎng)出軸突并延伸到附近的肌管

4、，但由于NG108-15細(xì)胞為小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞與大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞之融合細(xì)胞，其特性和功能狀態(tài)都遠(yuǎn)不能完全代替神經(jīng)元原代細(xì)胞，故在共培養(yǎng)3天后，NG108-15細(xì)胞逐漸凋亡，AchR的聚集也明顯降低。亦有研究證明，大鼠神經(jīng)元-肌肉共培養(yǎng)可以形成大量的早期NMJ，并可以檢測(cè)到神經(jīng)元軸突誘導(dǎo)的突觸后膜AchR的聚集，但由于原代骨骼肌衛(wèi)星肌細(xì)胞取材難度較大，純化過程較為繁雜，培養(yǎng)條件較高且傳至9代后細(xì)胞即出現(xiàn)衰老特征，不能無限代地進(jìn)行傳代培養(yǎng)

5、。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)馗倪M(jìn)，首次采用SD大鼠胎鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元原代細(xì)胞和C2C12細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，在體外建立一個(gè)穩(wěn)定的神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)模型，該共培養(yǎng)操作過程更為簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，細(xì)胞狀態(tài)佳，存活時(shí)間更久，且更易于分析，從而為進(jìn)一步研究體內(nèi)外神經(jīng)肌肉接頭功能狀態(tài)及再生奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元原代分離和培養(yǎng)
　　 研究目的:能夠熟練的進(jìn)行原代神經(jīng)細(xì)胞的提取與培

6、養(yǎng)，并進(jìn)行提純和鑒定，以獲取體外形成神經(jīng)肌肉接頭所需的胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。
　　 材料和方法:取孕15d～16d SD大鼠，取出胚胎大鼠腹側(cè)半脊髓組織，經(jīng)胰酶消化和機(jī)械破碎的方法處理分散成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)差速貼壁法純化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，置于無血清限定性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，倒置顯微下觀察神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化，并采用免疫熒光法檢測(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶多克隆抗體(ChAT)以鑒定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。

7、
　　 結(jié)果:孕15d～16d胎鼠易于取材且所得運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量多、狀態(tài)好、細(xì)胞活力旺盛，聯(lián)合Neurobasal+2％ B27培養(yǎng)基培養(yǎng)的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞純度高，約為85％，能夠在體外培養(yǎng)條件下存活7～10d左右，ChAT反應(yīng)結(jié)果呈現(xiàn)陽性。
　　 結(jié)論:通過采用胎齡15d～16d胎鼠脊髓腹側(cè)半聯(lián)合無血清特定性培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的方法成功分離培養(yǎng)并獲得純度較高的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，ChAT能夠特異性標(biāo)記脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元

8、，且培養(yǎng)前5～7天，MNs數(shù)量穩(wěn)定，未見明顯減少，為課題實(shí)施提供可靠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來源，同時(shí)也為后續(xù)共培養(yǎng)體系的建立在時(shí)間上創(chuàng)造了條件。
　　 第二部分成肌細(xì)胞C2C12體外成肌分化模型的建立
　　 研究目的:完善肌母細(xì)胞C2C12體外培養(yǎng)方法，觀察細(xì)胞增殖、分化、融合成肌的生物學(xué)特性。
　　 材料與方法:體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞C2C12，在含10％胎牛血清的增殖培養(yǎng)液(GM)中擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為60％～70％

9、時(shí)，換為含2％馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡下觀察各個(gè)階段骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)特征變化并拍照。采用免疫熒光法抗肌球蛋白重鏈抗體MHC特異性標(biāo)記肌管。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)時(shí)，C2C12細(xì)胞匯合至60％～70％時(shí)，換DM誘導(dǎo)分化，即開始逐步相互融合形成肌管細(xì)胞并表達(dá)MHC蛋白，約5d左右形成成熟的肌管，MHC特異性反應(yīng)呈陽性。
　　 結(jié)論:成肌細(xì)胞C2C12體外培養(yǎng)時(shí)能夠穩(wěn)定傳代，無需特殊誘導(dǎo)方法，用含2％馬血

10、清的分化培養(yǎng)液(DM)即可誘導(dǎo)分化形成成熟的肌管細(xì)胞，為共培養(yǎng)體系的建立提供穩(wěn)定的骨骼肌肌管來源。
　　 第三部分運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立
　　 研究目的:獲得運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)條件，建立運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元-骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，在體外形成神經(jīng)肌肉接頭。
　　 材料與方法:C2C12成肌細(xì)胞株體外擴(kuò)增培養(yǎng)至60％～70％匯合時(shí)，分化培養(yǎng)基(DM)誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)約3d，開始分化融合形成肌管。取孕15

11、d～16dSD大鼠，提取胚胎大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞，種植到分化5d的肌管細(xì)胞中，含2％馬血清的分化培養(yǎng)液(DM)共培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察各個(gè)階段神經(jīng)元形態(tài)及突起長(zhǎng)度的變化、肌管形態(tài)特征變化及收縮特性、神經(jīng)肌肉接頭的形成。通過活體細(xì)胞孵育alpha-bungarotoxin(a-BTX)觀察突觸后膜AchR的位置及分布，并采用屏幕錄像技術(shù)記錄共培養(yǎng)中肌肉收縮現(xiàn)象，這從另一個(gè)方面證明共培養(yǎng)后NMJ的形成。
　　 結(jié)果:更換為共培

12、養(yǎng)培養(yǎng)基后，SKMs和MNs均能存活并進(jìn)一步地分化成熟。在共培養(yǎng)細(xì)胞中，MNs在形態(tài)學(xué)上易于鑒別，共培養(yǎng)約4h后，倒置顯微鏡下可觀察到部分脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元開始貼壁，呈單個(gè)圓形或橢圓形，12h后，大部分細(xì)胞均已貼壁，24h后，NMs胞體逐漸形成突起，肌管細(xì)胞迸一步融合增粗并相互形成網(wǎng)絡(luò)狀，第3d～5d，神經(jīng)元生長(zhǎng)旺盛、胞體飽滿、光暈明顯、突起增多并延長(zhǎng)，部分NMs開始與肌管細(xì)胞形成連接;約1周左右可見NMs伸出的軸突延伸至肌管膜表面或包繞肌