離體脊髓運動神經(jīng)元-頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元突觸形成及特征的初步研究.pdf

1、截癱病人可通過手術(shù)建立體神經(jīng)-內(nèi)臟神經(jīng)反射弧，重構(gòu)膀胱的神經(jīng)支配，達(dá)到功能重建的目的。在此過程中，出現(xiàn)了一種全新類型的突觸——軀體運動神經(jīng)與內(nèi)臟神經(jīng)的吻合建立了有功能的突觸聯(lián)系，但迄今缺乏對該類突觸的認(rèn)識。近年，經(jīng)過對軀體運動神經(jīng)——內(nèi)臟神經(jīng)吻合后形成的突觸進(jìn)行了在體研究，發(fā)現(xiàn)其主要的神經(jīng)遞質(zhì)仍為乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，其可塑性獨具特征。但囿于吻合術(shù)導(dǎo)致的組織粘連、炎性反應(yīng)及組織成分的復(fù)雜性，無法去除“干擾”而對

2、該類神經(jīng)元突觸的基本特征作系統(tǒng)、全面的研究，迄今為止，僅為軀體運動神經(jīng)元與副交感節(jié)后神經(jīng)元形成的突觸，業(yè)已知道，生理狀態(tài)下脊髓前角運動神經(jīng)元和副交感節(jié)前神經(jīng)元釋放的主要神經(jīng)遞質(zhì)均為ACh，且吻合術(shù)后的在體研究亦證實其主要遞質(zhì)仍為ACh，那么，該突觸的形成是因為其具有相同的神經(jīng)遞質(zhì)和相應(yīng)的受體嗎?是否只要能合成、釋放相同神經(jīng)遞質(zhì)及具有相應(yīng)受體的神經(jīng)元，不論是同類神經(jīng)元(都是軀體運動)還是異類神經(jīng)元(軀體運動與內(nèi)臟)都能建立功能性的突觸聯(lián)系

3、?交感神經(jīng)的節(jié)前纖維釋放的遞質(zhì)也主要為ACh，也與運動神經(jīng)元釋放的遞質(zhì)相同，那么，運動神經(jīng)元與交感神經(jīng)的節(jié)后神經(jīng)元能建立有功能的突觸聯(lián)系嗎? 本研究中，首先分離培養(yǎng)脊髓運動神經(jīng)元(spinal motoneuron，SMN)和頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(superior cervical ganglion netiron，SCGN)。培養(yǎng)液中添加促運動神經(jīng)元最強(qiáng)的細(xì)胞因子——膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived

4、neurotrophic factor，GDNF)和交感神經(jīng)元生長不可缺少的神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)，將二者添加在條件培養(yǎng)基Neurobasal reediurn A、B27復(fù)合添加劑中，制成全培養(yǎng)液，以此全培養(yǎng)液分別原代培養(yǎng)SMN和SCGN，其間采用差速貼壁法對SMN進(jìn)行純化，觀察了它們生長情況，并用神經(jīng)元的標(biāo)志物NF200抗體分別與SMN的標(biāo)記物ChAT抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP抗體作免

5、疫熒光雙標(biāo)，輔以Hoechst核染熒光顯示細(xì)胞核，計數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞中SMN量和SCGN量；其次，建立離體培養(yǎng)的SMN-SCGN突觸模型。用瓊脂糖和PDL對培養(yǎng)蓋片進(jìn)行“微島化”處理，在其上低密度培養(yǎng)SCGN，隨后用熒光染料DiI予以標(biāo)記，再將經(jīng)差速貼壁的E16 d胎鼠脊髓腹側(cè)組織制成的細(xì)胞懸液接種于其上，即作SMN和SCGN的共培養(yǎng)，用突觸形成的標(biāo)記物p38抗體和ChAT作免疫熒光雙標(biāo)，顯示以SMN為突觸前神經(jīng)元的突觸形成情況，并用突觸計數(shù)

6、、Western blot和RT-PCR揭示突觸形成的情況，結(jié)合電鏡觀察佐證SMN-SCGN突觸的形成，再在SCGN上記錄微小自發(fā)突觸后電流(miniature spontaneous current，mSPC)，證明功能性突觸的形成；再次，借助煙堿型受體的特異性阻斷劑(HEX)和乙酰膽堿脂酶抑制劑(THA)，輔以谷氨酸非NMDA受體阻斷劑(CNQX)，對SMN-SCGN突觸的神經(jīng)遞質(zhì)和受體作初步研究；最后，外源性加入星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培

7、養(yǎng)基(ACM)，觀察其對SMN-SCGN突觸形成的影響。主要結(jié)果： 1．按此方法原代培養(yǎng)的SMN和SCGN生長狀態(tài)好，SMN在培養(yǎng)14 d后，生長暈消失，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)小的黑色顆粒和空泡狀結(jié)構(gòu)，突起斷裂，大部分細(xì)胞變圓、變暗，可見少許散在的細(xì)胞碎片，逐漸開始衰老；而SCGN培養(yǎng)16 d時，仍生長暈清晰，細(xì)胞狀態(tài)好。經(jīng)NF200、ChAT和GFAP免疫熒光及Hoechst核染顯示：神經(jīng)元純度達(dá)87.8％，sMN純度達(dá)70.9％，而SC

8、GN純度更高達(dá)95％； 2．SCGN培養(yǎng)1 d后，可用DiI進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)標(biāo)記的神經(jīng)元發(fā)紅色熒光，熒光長期存在，且不會影響其存活狀態(tài)； 3．SMN和SCGN能在經(jīng)“微島化”處理的蓋片上作共培養(yǎng)，共培養(yǎng)組的突觸計數(shù)要顯著高于SCGN組和SMN組； 4．Western blot提示：在SCGN組未能檢測出p38，而共培養(yǎng)組p38含量要顯著高于SMN組； 5．RT-PCR提示：共培養(yǎng)組p38mRNA表達(dá)要顯著高于

9、SCGN組和SMN組之總和； 6．共培養(yǎng)組經(jīng)篩選、定位，電鏡觀察到突觸樣結(jié)構(gòu)； 7．培養(yǎng)4 d時，僅在共培養(yǎng)組的SCGN上能記錄到微小自發(fā)突觸后電流，而SCGN組的SCGN上不能記錄到微小自發(fā)突觸后電流； 8．六烴季銨能阻斷共培養(yǎng)組SCGN上記錄到的微小自發(fā)突觸后電流，THA能增強(qiáng)其微小自發(fā)突觸后電流，而CNQx對該錄微小自發(fā)突觸后電流無作用； 9．ACM能增強(qiáng)共培養(yǎng)的SCGN上記錄到的微小自發(fā)突觸后電流

10、，頻率增加、電流幅度增大。 主要結(jié)論： 1．SMN和SCGN能用相同的無血清全培養(yǎng)液進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)純度高，SMN存活14 d以后，可能會老化，而SCGN則能存活更長時間； 2．在經(jīng)“微島化”處理的蓋片上作共培養(yǎng)，SMN與SCGN之間能建立功能性的異類神經(jīng)元突觸聯(lián)系，形成SMN-SCGN突觸模型； 3．SMN-SCGN突觸的神經(jīng)遞質(zhì)為乙酰膽堿，受體為煙堿型N1受體； 4．ACM能促進(jìn)SMN-SC

11、GN突觸的的形成； 5．在體外培養(yǎng)條件下，分泌相同神經(jīng)遞質(zhì)和具有相應(yīng)受體的不同類型神經(jīng)元(軀體運動神經(jīng)元和內(nèi)臟神經(jīng)元)間能形成功能性的突觸聯(lián)系，其主要神經(jīng)遞質(zhì)和受體不發(fā)生改變，且同樣受膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控。 總之，本研究通過分離培養(yǎng)SMN和SCGN，以微島共培養(yǎng)的方法建立SMN-SCGN突觸模型，并采用免疫熒光雙標(biāo)、Western blot、RT-PCR、透射電鏡和膜片鉗方法，確認(rèn)其功能性突觸的形成，確認(rèn)其神經(jīng)遞質(zhì)為ACh，受