N-乙酰半胱氨酸對運動神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種少見但致死性的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,它選擇性侵犯大腦皮層、脊髓和腦干的運動神經(jīng)元。臨床表現(xiàn)為緩慢進(jìn)展的四肢無力,逐漸喪失運動功能,最終累及呼吸肌,多在首次出現(xiàn)癥狀后的3～5年內(nèi)死亡。目前,該病病因不清、發(fā)病機(jī)制不明、缺乏切實有效的治療方法。大量證據(jù)提示ALS運動神經(jīng)元的選擇性丟失并不是單一因素造成,而是由于多種因素復(fù)雜的相互作用所致,包括氧化應(yīng)激

2、,谷氨酸興奮毒性,遺傳因素,自身免疫異常,細(xì)胞骨架異常以及蛋白質(zhì)異常聚積等。而氧化應(yīng)激則是其各種不同機(jī)制的最后共同通路。
　　 目前ALS的治療主要包括興奮性氨基酸拮抗劑力魯唑(riluzole)、抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、基因治療、免疫治療以及干細(xì)胞移植治療等方面。其中,興奮性氨基酸拈抗劑力魯唑是唯一用于臨床有效的藥物,也是唯一被美國FDA批準(zhǔn)用于ALS臨床治療的藥物,但它也只能輕微延緩疾病的進(jìn)展(延長壽命90天),而對運動功能

3、、肌力和運動癥狀的改善無任何作用,并且價格昂貴,非一般家庭所能承受。因此,對于ALS患者來說,亟需一種價格低廉又切實有效的藥物。
　　 綠茶是一種流行世界的飲料,歷來被認(rèn)為是一種有益健康的飲品。近來研究表明,綠茶發(fā)揮有益作用的是綠茶葉中的一類多酚類物質(zhì),它們都屬于黃酮類,合稱綠茶多酚,主要包括四種有效成份:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatec

4、hin gallate,ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)和表茶素(epicatechin,EC)。其中EGCG含量最高,大約占到綠茶提取物干重的10％,具有抗凋亡、抗癌、抗突變、抗炎等作用。近年來被廣泛研究,證實其還可在多個靶點發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,如自由基清除、金屬螯合、影響細(xì)胞存活和凋亡基因的表達(dá)、以及對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、線粒體功能和泛素.蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等。之前,我們應(yīng)用谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑蘇-羥天

5、冬氨酸(threohydroxyaspartate,THA)誘導(dǎo)細(xì)胞間隙內(nèi)谷氨酸濃度升高,造成谷氨酸興奮性毒性脊髓體外器官型培養(yǎng)模型,用EGCG預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)EGCG不僅能夠保護(hù)運動神經(jīng)元,減輕細(xì)胞損傷程度,減低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平,還能降低細(xì)胞間隙的谷氨酸濃度。這是一個非常令人振奮的結(jié)果,因為EGCG兼具了抗氧化和調(diào)節(jié)谷氨酸的雙重作用。但是也正因為EGCG還具有抗氧化作用,嚴(yán)格來說,我們并不能確定其調(diào)節(jié)谷氨酸的作用是否是抗氧化作用的一個附

6、加結(jié)果。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是一種廣為人知的抗氧化劑,它不僅具有直接的抗氧化作用,還能為谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成提供底物,而谷胱甘肽則是活性氧族(reactive oxygen species,ROS)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的清除劑。因此,為了進(jìn)一步確證EGCG的這個結(jié)果,本研究引入了NAC作為參照,觀察其在完全相同的體外培養(yǎng)模型中對運動神經(jīng)元的保護(hù)作用及其對細(xì)胞間隙谷氨酸濃度的

7、影響。
　　 方法:實驗動物選用7日齡的SD(Sprague-Dawley)乳鼠快速斷頭,在無菌條件下迅速取出脊髓,用活組織切片機(jī)切成350μm厚的薄片,種植在6孔培養(yǎng)板內(nèi)的插入式培養(yǎng)皿(30mm Millicell-CM,Millipore公司)中,每孔5片,放入二氧化碳培養(yǎng)箱(37.0℃,5％CO2+95％空氣),每周更換2次培養(yǎng)液。經(jīng)過1周的損傷恢復(fù)期后,在培養(yǎng)液中加入谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑蘇-羥天冬氨酸(threohydro

8、xyaspartate,THA),使細(xì)胞間隙谷氨酸濃度增加,造成谷氨酸興奮性毒性脊髓體外器官型培養(yǎng)模型。之后,脊髓片隨機(jī)分為正常對照組、THA模型組和NAC提前干預(yù)組,繼續(xù)培養(yǎng)3周后收集標(biāo)本及培養(yǎng)液。用神經(jīng)元的特異性抗體SMI-32組化染色,對脊髓前角運動神經(jīng)元進(jìn)行鑒定、計數(shù),并測定培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)活力以判斷細(xì)胞損傷程度,測定培養(yǎng)液中的谷氨酸(glutamate)濃度以判斷NAC能

9、否調(diào)節(jié)谷氨酸,測定脊髓組織中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以判斷細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平。
　　 結(jié)果:正常對照組脊髓片體外生長良好,面積逐漸增大,兩側(cè)前角共有24.13±3.44個運動神經(jīng)元。THA模型組脊髓片體外生長不良,與對照組相比,前角運動神經(jīng)元數(shù)明顯減少,僅6.27±1.62個(P＜0.05),且培養(yǎng)液中谷氨酸濃度,LDH活力明顯增加(P＜0.05),脊髓組織中MDA含量明顯增加(P＜0.05)。而N

10、AC提前干預(yù)組脊髓片生長與正常對照組相近,與模型組相比前角運動神經(jīng)元數(shù)目明顯增加,19.29±2.13個(P＜0.05),且培養(yǎng)液中LDH活力明顯下降(P＜0.05),脊髓組織中MDA含量明顯減少(P＜0.05),但培養(yǎng)液中的谷氨酸濃度無明顯變化(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:抗氧化劑NAC在谷氨酸興奮性毒性脊髓體外器官型培養(yǎng)模型中能夠保護(hù)運動神經(jīng)元,減輕細(xì)胞損傷程度,減低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平,但并不能直接調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙的谷氨酸水平