白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系MAPK炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用研究.pdf

1、[背景]
　　 眾所周知,絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)一類非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,MAPK家族有三條經(jīng)典的亞族通路分別是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2(extracellularsignal-related kinases 1 and 2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)、p38絲裂原活

2、化蛋白激酶(p38 Mitogen-ActivatedProtein Kinase,p38MAPK)。這些MAPK通路被脂多糖(LPS)等多種因素激活后,通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo),可產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì),從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展。ERK、JNK、p38MAPK通路活化的標(biāo)志是其磷酸化形式表達(dá)量的增多。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol)廣泛存在于藜蘆、虎杖、葡萄、花生等多種食物和食物中。最初作為一種植物抗毒素被發(fā)現(xiàn),目前因具

3、有可靠而廣泛的抗炎作用日益受到人們的重視。白藜蘆醇可用于腐蝕性食管炎、急性胰腺炎和結(jié)腸炎等多種炎癥性疾病的治療,但其具體的抗炎機(jī)制尚未清楚。既然MAPK通路可以促進(jìn)炎癥的發(fā)展,因此我們?cè)O(shè)想白藜蘆醇的抗炎機(jī)制是否與MAPK通路的抑制有關(guān)系。白藜蘆醇的抗炎機(jī)制與MAPK炎性通路關(guān)系的文章鮮有報(bào)道,本研究是在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7研究白藜蘆醇對(duì)MAPK炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。
　　 [目的]
　　 在RAW264.7研

4、究白藜蘆醇對(duì)MAPK炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。
　　 [方法]
　　 (1)檢測(cè)不同濃度的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)分組:①調(diào)零組:DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基組②空白對(duì)照組:未處理的細(xì)胞組③處理組:加入白藜蘆醇和脂多糖的細(xì)胞組,每個(gè)組設(shè)五個(gè)復(fù)孔。將密度為1×105/ml的細(xì)胞100μl接種于96孔板,在37℃,含有5％二氧化碳增濕的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)使細(xì)胞良好貼

5、壁,然后加入白藜蘆醇和脂多糖,使其白藜蘆醇培養(yǎng)基的終濃度分別為5 μ mol/l、10 μmol/l、15 μmol/l、30 μ mol/l,脂多糖的終濃度為1 μ g/ml,繼續(xù)孵育24小時(shí)后,加入10ul的cck-8(CellCounting Kit-8)溶液,混勻,孵育2個(gè)小時(shí),后用酶標(biāo)儀在450nm處掃描吸光度。
　　 (2)探索脂多糖激活MAPK的時(shí)間梯度。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,在37℃,含有5％二氧化碳增濕的培養(yǎng)箱

6、孵育,待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的百分之八十至九十時(shí)且生長(zhǎng)良好時(shí),將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出,超凈臺(tái)中加入脂多糖,混勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),本實(shí)驗(yàn)用六個(gè)不同的培養(yǎng)皿分別用來(lái)檢測(cè)不同的時(shí)間點(diǎn)脂多糖對(duì)MAPK的激活情況。待設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)到之后,將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出,倒掉培養(yǎng)基,用冷的PBS(phosphate-buffered saline).沖洗培養(yǎng)皿,后將PBS用干凈,加入細(xì)胞裂解液,用細(xì)胞刮刮除培養(yǎng)皿的皿底,將所得移入ep管中,置于冰上,裂解30分鐘

7、,期間每五分鐘震蕩一次,一次一分鐘,充分震蕩,后放入4℃離心機(jī),14000g離心5分鐘,取出后取上清,按照蛋白:上樣緩沖液等于4:1的比例加入上樣緩沖液,沸水中煮沸,使蛋白變性,零下20℃保存。BCA蛋白定量,sds-page凝膠等量上樣跑電泳,然后切膠,封閉,孵育一抗和二抗,然后發(fā)光顯影。
　　 (3)檢測(cè)不同濃度的白藜蘆醇對(duì)MAPK通路的影響。實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組、脂多糖組,脂多糖加不同濃度的白藜蘆醇組。將白藜蘆醇加入培養(yǎng)基中,

8、使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為5 μ mol/l、10 μ mol/l、15 μ mol/l、30 μ mol/l,孵育2個(gè)小時(shí)以后加入脂多糖共同孵育半個(gè)小時(shí),PBS清洗培養(yǎng)皿,裂解細(xì)胞,提取蛋白,BCA蛋白定量后,進(jìn)行western blot操作基本同前。
　　 [結(jié)果]:
　　 (1)不同濃度的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性的影響
　　 我們用CCK-8檢測(cè)了不同濃度的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性的影響,發(fā)現(xiàn)5-15μM濃度范圍的白

9、藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響,當(dāng)白藜蘆醇濃度達(dá)到30μM時(shí),細(xì)胞活性開(kāi)始下降。
　　 (2)脂多糖對(duì)MAPK通路的活化
　　 為了探索MAPK通路被脂多糖激活后,磷酸化蛋白的表達(dá)何時(shí)達(dá)到高峰,本實(shí)驗(yàn)在脂多糖刺激后的六個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)用western blot對(duì)MAPK通路蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),MAPK三個(gè)亞族磷酸化蛋白的表達(dá)都是在5分鐘時(shí)開(kāi)始升高,30分鐘時(shí)達(dá)到高峰,60分鐘時(shí)已經(jīng)下降。
　　 (3)白藜蘆醇對(duì)MAPK

10、通路的影響
　　 我們發(fā)現(xiàn)5-15 μM濃度范圍的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有影響,而當(dāng)白藜蘆醇濃度達(dá)到30 μ M時(shí),細(xì)胞活性開(kāi)始下降。因此在這一步的實(shí)驗(yàn)中選擇的藥物濃度為5-15 μM。5-15μ M濃度范圍的白藜蘆醇抑制了MAPK家族中p38 MAPK,JNK的磷酸化,5 μM的白藜蘆醇就可以抑制p38 MAPK的磷酸化,而對(duì)JNK磷酸化的抑制則需要白藜蘆醇的濃度達(dá)到15μM,5-15μM濃度范圍的白藜蘆醇對(duì)ERK的磷酸化沒(méi)有影