白藜蘆醇在脂多糖誘導的肝癌細胞增殖和侵襲轉移中的作用.pdf

1、研究背景：
　　炎癥與腫瘤密切相關。在能夠導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的誘因中，炎癥和慢性感染尤其吸引人們的注意。臨床資料統(tǒng)計得知，肝的慢性炎癥與肝癌的發(fā)生有著很強的相關性，肝細胞癌的發(fā)生率與慢性肝炎的發(fā)生率呈正相關。酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化等慢性肝損傷引起的肝的炎癥反應能夠促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展，但具體作用機制尚未完全明確。在體內(nèi)，炎癥刺激會引起一些能夠引起免疫耐受的細胞因子的釋放，這些細胞因子與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。據(jù)相關報道

2、，促炎性細胞因子、炎性細胞因子（IL-1b、IL-6等）在胃癌、胰腺癌、肺癌等癌患者血清中劇烈升高，體內(nèi)外研究已經(jīng)證實這些炎癥因子可以促進癌細胞增殖和腫瘤轉移。
　　脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，位于細胞壁的最外層，又稱內(nèi)毒素。在細菌性感染及急慢性炎癥發(fā)生時，LPS起重要的作用，可以刺激炎癥因子和氧自由基的釋放，而這些細胞因子及氧自由基與腫瘤的發(fā)生和進展有密切關系。最新研

3、究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物分泌 LPS能夠通過門靜脈到達肝臟組織，引起炎癥反應和激活肝星狀細胞和肝細胞，促進肝癌發(fā)生。但LPS能否直接作用于肝癌細胞引起其生物學行為的改變?nèi)圆磺宄?br>　　大量文獻報道，白藜蘆醇能抗氧化應激、抗炎、抗癌、抗衰老等，具有廣泛的生理及藥理學作用。白藜蘆醇能夠緩解關節(jié)炎和自身免疫疾病的炎癥反應及降低免疫應答。白藜蘆醇能夠拮抗多種器官炎癥，抑制促炎細胞因子生成，進而改善器官功能和修復炎癥損傷。白藜蘆醇還能夠抑制多種腫

4、瘤細胞的增殖與轉移，有很廣闊的臨床應用前景。白藜蘆醇抗腫瘤作用與其本身的生理及藥理學功能密切相關，其機制可能與白藜蘆醇能夠阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、促進腫瘤細胞分化、干擾相關信號轉導通路、抗腫瘤血管生成等有關。但其抗炎、抗腫瘤的具體機制仍未明確。
　　研究目的：
　　本研究旨在探討脂多糖對人肝癌細胞增殖與侵襲轉移的影響，觀察炎癥反應中PPAR-γ、TGF-β、P21、Bcl-2等基因的表達變化，以及白藜蘆醇在對脂多糖誘導的

5、肝癌細胞增殖與侵襲轉移的作用，為進一步探討炎癥反應與腫瘤的關系提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用噻唑藍(MTT)比色法檢測濃度分別為0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的LPS在不同時間內(nèi)對HepG2、SMMC7721細胞增殖的影響。
　　2.劃痕實驗分別觀察0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的LPS濃度對HepG2、SMM

6、C7721細胞遷移的影響。
　　3. Transwell小室分別檢測0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml藥物濃度對HepG2、SMMC7721細胞侵襲能力的影響。
　　4.實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測濃度為0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的LPS干預后，HepG2、SMMC7721細胞相關基因mRNA表達量的變化。
　　5.在20μg/ml脂多糖干預的同時，聯(lián)合使

7、用不同濃度的白藜蘆醇（50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）共同作用于肝癌細胞SMMC7721，觀察不同濃度白藜蘆醇對脂多糖誘導的肝癌細胞SMMC7721增殖、侵襲轉移以及有關目的基因mRNA的表達水平的影響。
　　結果：
　　1. MTT結果顯示，LPS能夠促進SMMC7721的增殖，且隨LPS濃度的增加和作用時間的延長，促進作用明顯加強，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低濃度的LPS對He

8、pG2細胞無促進增殖或抑制作用，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。高濃度的脂多糖（40μg/ml）對HepG2、SMMC7721均有抑制增殖的作用。
　　2.劃痕實驗結果顯示，不同濃度的脂多糖作用于SMMC7721細胞24 h后，SMMC7721細胞遷移能力增強，且隨藥物濃度增大，遷移作用逐漸增強，LPS濃度為20μg/ml時作用最強。而對于HepG2，脂多糖無促進遷移作用。
　　3. Transwell實驗結果顯

9、示，LPS作用SMMC7721細胞24 h之后，侵襲細胞數(shù)較對照組明顯增多，且LPS濃度越高發(fā)生侵襲的細胞數(shù)越多（P<0.01）。而使用不同濃度LPS干預HepG2細胞，HepG2細胞侵襲個數(shù)沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4. qPCR結果提示，不同濃度LPS作用SMMC7721細胞48 h后，Bcl-2、TGF-β表達水平均有不同程度的升高（P<0.01），而PPAR-γ、P21基因mRNA表達水平與不含

10、LPS組比較均有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。LPS作用HepG2細胞24h后PPAR-γ、TGF-β基因mRNA表達水平有所下降（P<0.01），P21、Bcl-2的mRNA表達水平與無LPS組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　5.使用不同濃度白藜蘆醇與20μg/ml LPS共同作用于肝癌細胞SMMC7721，MTT結果顯示，不同濃度白藜蘆醇均能不同程度的抑制LPS誘導的SMMC7721細胞的增殖；且隨白

11、藜蘆醇濃度的增加，抑制SMMC7721細胞增殖效應增強（P<0.01)。劃痕實驗結果顯示，白藜蘆醇能夠抑制LPS誘導的SMMC7721細胞遷移；Transwell小室實驗結果顯示，LPS作用的同時，加入不同濃度白藜蘆醇，SMMC7721細胞的侵襲細胞數(shù)較對照組明顯減少，且白藜蘆醇濃度越高發(fā)生侵襲的細胞數(shù)越少（P<0.01）。qPCR結果提示，不同濃度白藜蘆醇作用于SMMC7721細胞48 h后，Bcl-2、TGF-β表達水平均有不同程度

12、的下降（P<0.01），而PPAR-γ、P21基因mRNA表達水平與只加LPS組比較均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結論：
　　1.脂多糖可促進SMMC7721的的增殖、侵襲與轉移。
　　2.脂多糖可顯著上調(diào)SMMC7721 Bcl-2、TGF-β mRNA表達水平，下調(diào)PPAR-γ、P21 mRNA表達水平。
　　3.脂多糖對HepG2細胞的增殖、侵襲與轉移無影響，但能改變PPAR-