白藜蘆醇在脂多糖誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、研究背景：
　　炎癥與腫瘤密切相關(guān)。在能夠?qū)е履[瘤發(fā)生、發(fā)展的誘因中，炎癥和慢性感染尤其吸引人們的注意。臨床資料統(tǒng)計(jì)得知，肝的慢性炎癥與肝癌的發(fā)生有著很強(qiáng)的相關(guān)性，肝細(xì)胞癌的發(fā)生率與慢性肝炎的發(fā)生率呈正相關(guān)。酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化等慢性肝損傷引起的肝的炎癥反應(yīng)能夠促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展，但具體作用機(jī)制尚未完全明確。在體內(nèi)，炎癥刺激會(huì)引起一些能夠引起免疫耐受的細(xì)胞因子的釋放，這些細(xì)胞因子與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。據(jù)相關(guān)報(bào)道

2、，促炎性細(xì)胞因子、炎性細(xì)胞因子（IL-1b、IL-6等）在胃癌、胰腺癌、肺癌等癌患者血清中劇烈升高，體內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)這些炎癥因子可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，位于細(xì)胞壁的最外層，又稱內(nèi)毒素。在細(xì)菌性感染及急慢性炎癥發(fā)生時(shí)，LPS起重要的作用，可以刺激炎癥因子和氧自由基的釋放，而這些細(xì)胞因子及氧自由基與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有密切關(guān)系。最新研

3、究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物分泌 LPS能夠通過門靜脈到達(dá)肝臟組織，引起炎癥反應(yīng)和激活肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞，促進(jìn)肝癌發(fā)生。但LPS能否直接作用于肝癌細(xì)胞引起其生物學(xué)行為的改變?nèi)圆磺宄?br>　　大量文獻(xiàn)報(bào)道，白藜蘆醇能抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗癌、抗衰老等，具有廣泛的生理及藥理學(xué)作用。白藜蘆醇能夠緩解關(guān)節(jié)炎和自身免疫疾病的炎癥反應(yīng)及降低免疫應(yīng)答。白藜蘆醇能夠拮抗多種器官炎癥，抑制促炎細(xì)胞因子生成，進(jìn)而改善器官功能和修復(fù)炎癥損傷。白藜蘆醇還能夠抑制多種腫

4、瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，有很廣闊的臨床應(yīng)用前景。白藜蘆醇抗腫瘤作用與其本身的生理及藥理學(xué)功能密切相關(guān)，其機(jī)制可能與白藜蘆醇能夠阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、干擾相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抗腫瘤血管生成等有關(guān)。但其抗炎、抗腫瘤的具體機(jī)制仍未明確。
　　研究目的：
　　本研究旨在探討脂多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的影響，觀察炎癥反應(yīng)中PPAR-γ、TGF-β、P21、Bcl-2等基因的表達(dá)變化，以及白藜蘆醇在對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的

5、肝癌細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的作用，為進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)與腫瘤的關(guān)系提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)濃度分別為0μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的LPS在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)HepG2、SMMC7721細(xì)胞增殖的影響。
　　2.劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的LPS濃度對(duì)HepG2、SMM

6、C7721細(xì)胞遷移的影響。
　　3. Transwell小室分別檢測(cè)0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml藥物濃度對(duì)HepG2、SMMC7721細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）檢測(cè)濃度為0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的LPS干預(yù)后，HepG2、SMMC7721細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化。
　　5.在20μg/ml脂多糖干預(yù)的同時(shí)，聯(lián)合使

7、用不同濃度的白藜蘆醇（50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）共同作用于肝癌細(xì)胞SMMC7721，觀察不同濃度白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞SMMC7721增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及有關(guān)目的基因mRNA的表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1. MTT結(jié)果顯示，LPS能夠促進(jìn)SMMC7721的增殖，且隨LPS濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)作用明顯加強(qiáng)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。低濃度的LPS對(duì)He

8、pG2細(xì)胞無促進(jìn)增殖或抑制作用，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高濃度的脂多糖（40μg/ml）對(duì)HepG2、SMMC7721均有抑制增殖的作用。
　　2.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的脂多糖作用于SMMC7721細(xì)胞24 h后，SMMC7721細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，且隨藥物濃度增大，遷移作用逐漸增強(qiáng)，LPS濃度為20μg/ml時(shí)作用最強(qiáng)。而對(duì)于HepG2，脂多糖無促進(jìn)遷移作用。
　　3. Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

9、示，LPS作用SMMC7721細(xì)胞24 h之后，侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多，且LPS濃度越高發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)越多（P<0.01）。而使用不同濃度LPS干預(yù)HepG2細(xì)胞，HepG2細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4. qPCR結(jié)果提示，不同濃度LPS作用SMMC7721細(xì)胞48 h后，Bcl-2、TGF-β表達(dá)水平均有不同程度的升高（P<0.01），而PPAR-γ、P21基因mRNA表達(dá)水平與不含

10、LPS組比較均有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。LPS作用HepG2細(xì)胞24h后PPAR-γ、TGF-β基因mRNA表達(dá)水平有所下降（P<0.01），P21、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平與無LPS組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　5.使用不同濃度白藜蘆醇與20μg/ml LPS共同作用于肝癌細(xì)胞SMMC7721，MTT結(jié)果顯示，不同濃度白藜蘆醇均能不同程度的抑制LPS誘導(dǎo)的SMMC7721細(xì)胞的增殖；且隨白

11、藜蘆醇濃度的增加，抑制SMMC7721細(xì)胞增殖效應(yīng)增強(qiáng)（P<0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇能夠抑制LPS誘導(dǎo)的SMMC7721細(xì)胞遷移；Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS作用的同時(shí)，加入不同濃度白藜蘆醇，SMMC7721細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，且白藜蘆醇濃度越高發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)越少（P<0.01）。qPCR結(jié)果提示，不同濃度白藜蘆醇作用于SMMC7721細(xì)胞48 h后，Bcl-2、TGF-β表達(dá)水平均有不同程度

12、的下降（P<0.01），而PPAR-γ、P21基因mRNA表達(dá)水平與只加LPS組比較均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.脂多糖可促進(jìn)SMMC7721的的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　2.脂多糖可顯著上調(diào)SMMC7721 Bcl-2、TGF-β mRNA表達(dá)水平，下調(diào)PPAR-γ、P21 mRNA表達(dá)水平。
　　3.脂多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移無影響，但能改變PPAR-