天然免疫細胞產(chǎn)生的微顆粒在肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其機制.pdf

1、目的：腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學特征之一,也是臨床惡性腫瘤患者死亡的首要因素。但是,腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制尚不十分清楚。傳統(tǒng)細胞融合理論認為腫瘤細胞和白細胞相互融合形成轉(zhuǎn)移細胞,腫瘤細胞從而被賦予了白細胞的移行能力。近年來研究證明,白細胞釋放的微顆粒作為一種新的信息傳遞物質(zhì)與腫瘤細胞的相互融合參與了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移機制。另外,腫瘤細胞在繼發(fā)部位形成轉(zhuǎn)移瘤與白細胞募集到炎癥部位的過程都需要黏附分子所介導的細胞和內(nèi)皮細胞間黏附作用

2、。白細胞整合素亞家族成員,如αLβ2和αMβ2是參與白細胞黏附的重要分子,肝癌細胞能否利用這些黏附分子介導其轉(zhuǎn)移的發(fā)生尚不清楚。本研究檢測了免疫細胞產(chǎn)生的微顆粒及其攜帶的黏附分子表型在肝癌細胞表達,進一步通過細胞和動物模型探索了肝癌細胞通過微顆粒途徑獲得黏附分子并介導其侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法：
　　1.免疫細胞微顆粒的制備和檢測
　　BALB/c來源的脾細胞用50ng/mlPMA刺激12h后將脾細胞懸液超速200

3、00g×60min離心所得沉淀洗1次后重懸至PBS緩沖液,流式細胞術和雙光子共聚焦顯微鏡成像技術檢測微顆粒的大小和數(shù)量。
　　2.微顆粒和負載微顆粒的肝癌細胞表面免疫分子的檢測
　　將微顆粒懸液和腫瘤細胞共孵育20h后PBS緩沖液輕柔洗2次,所得沉淀即是融合有微顆粒的腫瘤細胞。將微顆粒和負載微顆粒的H22融合細胞分別用熒光抗體4℃染色30min,PBS緩沖液洗3次離心后將微顆粒和細胞沉淀分別加入300μl PBS緩沖液重懸,

4、行流式細胞術檢測和分析。
　　3.趨化實驗
　　趨化實驗采用8-μm孔徑的24孔Trans-well板進行。將25μl配制好的基底膠(5μg in10μl serum-free RPMI1640)滴入孔板上室,使其完全覆蓋上室底部形成薄膜并置于37℃溫箱孵育過夜。小室上層加入200μl細胞懸液,下層加入600μl含20％FBS的RPMI1640細胞培養(yǎng)基。Trans-well板在37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中孵育20h后,對趨化

5、的細胞染色并顯微鏡下計數(shù)。
　　4.動物實驗
　　本實驗所選擇的動物為6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。將不同處理組的微顆粒分別和H22細胞共同孵育20h制備融合細胞,取一等份融合H22細胞加入20μg/ml抗CD18或CD11b中和性抗體,繼續(xù)孵育4h阻斷CD18或CD11b的表達,封閉后細胞沉淀重懸于0.9％的生理鹽水中備用。每只小鼠尾靜脈注射3×105H22細胞,封閉組小鼠注射細胞4h后按照30μg/只補充注射CD18

6、或CD11b中和性抗體1次,各組小鼠飼養(yǎng)70天左右并觀察成瘤情況。
　　結果：
　　1.PMA活化的免疫細胞釋放微顆粒
　　采用50ng/ml的PMA刺激BALB/c小鼠脾臟來源的免疫細胞12h后取細胞培養(yǎng)上清低溫超速離心獲得沉淀并重懸于PBS緩沖液中,流式細胞術檢測微顆粒的大小和數(shù)量。結果顯示免疫細胞經(jīng)過PMA刺激活化后可釋放微顆粒,且PMA活化細胞釋放的微顆粒約為未活化細胞釋放微顆粒的6倍。雙光子共聚焦顯微鏡成像技

7、術觀測微顆粒的直徑均小于1μm。
　　2.免疫細胞產(chǎn)生的微顆粒表型的表達
　　對微顆粒進行免疫細胞特異性標志物的熒光抗體染色。流式細胞術檢測結果示PMA處理組的微顆粒,其CD3和CD19分子的表達輕微增加,而Gr-1和F4/80分子的表達增加較為顯著。提示微顆粒攜帶有其母細胞來源的多種表型分子,且相對于T細胞或B細胞而言,在PMA刺激下以髓性細胞產(chǎn)生的微顆粒為主。
　　3.肝癌細胞可攝取免疫細胞產(chǎn)生的微顆粒并表達其表型

8、
　　將微顆粒和H22細胞共同孵育20h后行H22細胞的免疫學標志物流式細胞術檢測。結果顯示H22細胞表面不同程度的表達微顆粒來源的免疫表型,如CD19、Gr-1、F4/80、CD3和MHC-II分子。提示免疫細胞通過微顆粒途徑可將其免疫學表型轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞,從而賦予腫瘤細胞新的免疫表型。
　　4.免疫細胞活化產(chǎn)生的微顆粒對H22細胞趨化性的影響
　　為了探索腫瘤細胞在獲得新表型后生物學功能的改變,采用趨化實驗檢測H2

9、2細胞的能動性和侵襲轉(zhuǎn)移能力。結果可見control-MP-H22組遷移至下室的細胞數(shù)較未處理組有少量增加,而PMA-MP-H22組遷移至下室的細胞數(shù)較control-MP-H22組顯著增加。
　　為了進一步證明H22細胞在獲得免疫細胞來源的表型后其在小鼠體內(nèi)的生物學功能,設計了BALB/c小鼠體內(nèi)檢測模型。各組小鼠尾靜脈注射細胞后持續(xù)觀察70天左右,期間發(fā)現(xiàn)PMA-MP-H22細胞注射組的小鼠在軀體不同部位長出腫瘤,繼而死亡。c

10、ontrol-MP-H22組有1只小鼠長出腫瘤,而未處理H22細胞組小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長,并且PMA-MP-H22細胞組小鼠生存期明顯短于未處理H22細胞組小鼠。
　　5.CD11b/CD18通過微顆粒途徑介導H22細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　將負載有微顆粒的腫瘤細胞和中和性CD11b或CD18抗體分別孵育檢測腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。趨化實驗結果可見阻斷CD11b或CD18的表達后,H22細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力較阻斷前明顯減弱。各組小鼠

11、尾靜脈注射細胞后持續(xù)觀察70天左右。結果發(fā)現(xiàn)PMA-MP-H22細胞注射組小鼠在不同時間段分別長出腫瘤,且部位隨機,而未處理H22細胞注射組小鼠未發(fā)現(xiàn)有腫瘤生長。另外,CD11b或CD18分子阻斷組小鼠分別有1只和2只小鼠長出腫瘤。各處理組小鼠生存曲線可見PMA-MP-H22細胞組小鼠生存期明顯短于未處理H22細胞組。而CD11b或CD18分子阻斷組小鼠生存期較之PMA-MP-H22細胞注射組有所延長。以上結果說明,H22細胞經(jīng)過PMA

12、-MP處理后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強,而當阻斷黏附分子CD11b或CD18的表達后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力則明顯減弱。
　　6.天然免疫細胞來源的微顆粒對H22細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響
　　為了證明免疫細胞的哪一亞群產(chǎn)生的微顆粒促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,將BALB/c小鼠脾臟的免疫細胞進行磁珠分選后獲得T細胞、B細胞和不含有T、B細胞(天然免疫細胞)的三組細胞,將各組細胞 PMA刺激活化12h和H22細胞共孵育20h后分別加入Trans

13、-well孔板上室,計數(shù)移動至下室的細胞。趨化實驗結果顯示B-MP和T-MP處理組遷移至下室的細胞較未處理稍有增加,而innate-MP處理組遷移至下室的細胞較未處理組顯著增加,提示天然免疫細胞產(chǎn)生的微顆粒在促進H22細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。
　　7.TIL產(chǎn)生的微顆粒對肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響
　　采用凍融上清刺激TIL活化產(chǎn)生微顆粒,流式細胞術檢測結果示 FTS活化刺激TIL后產(chǎn)生的微顆粒,其CD11b/CD1

14、8分子的表達較未刺激組不同程度的增加。進一步將微顆粒和H22細胞共同孵育20h,流式細胞術檢測結果示H22細胞表面不同程度的表達微顆粒所攜帶的整合素分子CD11b/CD18。采用趨化實驗檢測H22細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力結果可見,rest TIL-MP組遷移至下室的細胞較未處理組有少量增加,FTS-TIL-MP組遷移至下室的細胞較rest TIL-MP組增加。當阻斷CD11b或CD18分子的表達后,H22細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力較阻斷前明顯減弱。最

15、后,設計BALB/c小鼠體內(nèi)檢測模型進一步證明,各組小鼠尾靜脈注射細胞后持續(xù)觀察70天左右,發(fā)現(xiàn)FTS-TIL-MP組小鼠在不同時間段軀體不同部位長出腫瘤,繼而死亡,rest TIL-MP組和未處理H22細胞組小鼠則未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長,CD11b或CD18分子阻斷組分別有1只和3只小鼠長出腫瘤。觀測各組小鼠的生存期結果顯示FTS-MP-H22注射組小鼠生存期明顯短于未處理H22細胞注射組小鼠,而CD11b或CD18阻斷組小鼠生存期較之FTS

16、-MP-H22注射組小鼠生存期有所延長。以上結果說明,H22細胞經(jīng)過FTS-TIL-MP處理后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力增強,而當阻斷整合素CD11b或CD18分子的表達后,其侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。
　　結論：本課題研究證明免疫細胞來源的微顆?？梢员荒[瘤細胞所攝取,使腫瘤細胞獲得免疫細胞的生物學特性,促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。趨化實驗和體內(nèi)封閉實驗證實整合素CD11b/CD18分子在微顆粒途徑介導H22細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起一定作用,微顆粒通過轉(zhuǎn)運