N-cadherin在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機制研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　第一部分、N-cadherin在肝癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
　　目的：研究N-cad在肝癌中的表達(dá)情況及與臨床病理特征、術(shù)后生存的關(guān)系。
　　方法：收集手術(shù)切除的肝癌及癌旁組織64例標(biāo)本以及血管瘤病人手術(shù)切除的正常肝組織5例，免疫組化及蛋白印記檢測N-cad在肝癌，癌旁及正常肝組織中的表達(dá)；回顧性分析N-cad的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；術(shù)后病人隨訪，做生存分析。
　　結(jié)果：N-c

2、adherin在正常肝組織及癌旁組織中呈均一膜表達(dá)，而在肝癌組織表達(dá)缺失，缺失率達(dá)53％(34/64)。64例肝癌中，低分化肝癌有33例，N-cad表達(dá)缺失的25例，占76％；中度分化的肝癌19例，N-cad缺失的有6例，占32％，高分化的肝癌有12例，缺失的有3例，占25％，有顯著性差異（P＜0.01）；N-cad在伴有門脈癌栓或血管侵犯的肝癌中缺失率高達(dá)92％（11/12），有顯著性差異（P＜0.01）。N-cad缺失表達(dá)與病人年齡

3、、肝硬化、腫瘤大小等無關(guān)。此外，N-cad缺失表達(dá)組的肝癌術(shù)后病人的無瘤生存率較N-cad表達(dá)組低（P＜0.05）,而缺失表達(dá)組與表達(dá)組總生存率無顯著性差異（P=0.108）。
　　結(jié)論：N-cad在肝癌中表達(dá)缺失，且與腫瘤分化以及血管侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)；N-cad缺失表達(dá)的肝癌病人術(shù)后無瘤生存率較N-cad表達(dá)組低。
　　第二部分、敲減N-cadherin對肝癌細(xì)胞HCCLM3粘附及侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　目的：體外研究N-c

4、ad對肝癌細(xì)胞HCCLM3增殖、粘附及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法：利用RNA干擾技術(shù)敲減肝癌細(xì)胞HCCLM3中N-cad的表達(dá)，建立穩(wěn)定敲減N-cad的細(xì)胞株；利用細(xì)胞計數(shù)檢測N-cad對細(xì)胞增殖的影響，利用細(xì)胞間聚集實驗檢測N-cad對細(xì)胞間粘附的影響，利用Transwell系統(tǒng)檢測N-cad對細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：成功建立了穩(wěn)定敲減N-cad的細(xì)胞株，其中Ncad1，N-cad2和N-cad7,N-cad9細(xì)胞

5、克隆中N-cad的表達(dá)明顯減低，而對照組eGFP1，eGFP2以及HCCLM3細(xì)胞中N-cad表達(dá)沒有減低。敲減N-cad后HCCLM3細(xì)胞增殖沒有變化。細(xì)胞聚集實驗表明，在敲減的細(xì)胞克隆N-cad2，N-cad7中，成團(tuán)細(xì)胞較對照組eGFP1減少；對照組eGFP1的聚集指數(shù)為11％，而N-cad2，N-cad7細(xì)胞聚集指數(shù)分別增加到24％和27％，實驗組與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），而N-cad2與N-cad7之間沒有統(tǒng)

6、計學(xué)差異。細(xì)胞遷移侵襲實驗結(jié)果表明，實驗組N-cad2、N-cad7穿膜或鋪matrigel的細(xì)胞較對照組eGFP1明顯增多，有統(tǒng)計學(xué)差異P＜0.01，而兩實驗組沒有差異。
　　結(jié)論：敲減N-cad表達(dá)減弱細(xì)胞間粘附作用，增強了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　第三部分、N-cadherin表達(dá)缺失促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究
　　目的：研究探討敲減N-cad促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　方法：免疫熒光和wes

7、tern blot檢測敲減N-cad細(xì)胞克隆中β-catenin的表達(dá)，檢測Wnt/β-catenin的靶基因cyclin D1表達(dá)，同時在肝癌組織中檢測N-cad及β-catenin表達(dá)，分析兩者表達(dá)的關(guān)系。
　　結(jié)果：在敲減N-cad表達(dá)的細(xì)胞克隆N-cad2，N-cad7中，細(xì)胞核沒有β-catenin聚集；與對照組細(xì)胞相比，細(xì)胞膜上的β-catenin的表達(dá)減弱；western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總的β-catenin蛋白

8、在細(xì)胞克隆N-cad2，N-cad7中表達(dá)減低，而cyclin D1表達(dá)沒有改變。在肝癌組織中，當(dāng)N-cad表達(dá)缺失時，細(xì)胞膜上β-catenin表達(dá)也減弱。
　　結(jié)論：敲減N-cad表達(dá)后，Wnt/β-catenin途徑?jīng)]有激活，其促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具有分子機制仍需進(jìn)一步研究；細(xì)胞粘附作用減弱可能起部分作用。
　　第四部分、肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的建立
　　目的：建立肝癌肺轉(zhuǎn)移模型，為后續(xù)動物實驗奠定基礎(chǔ)。
　　方法：

9、5×106/200μL HCCLM3細(xì)胞接種裸鼠皮下，監(jiān)測腫瘤的生長；待腫瘤直徑為1cm時，取下腫瘤，剪成大小為1×1×1mm3組織塊，在新的裸鼠上進(jìn)行肝內(nèi)瘤組織塊原位接種；不同時間點解剖裸鼠，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察轉(zhuǎn)移灶。
　　結(jié)果：皮下接種10天左右，可觸及腫瘤；2周左右，腫瘤直徑可達(dá)1cm左右。肝內(nèi)接種術(shù)后第35天，解剖發(fā)現(xiàn)接種部位均形成腫瘤，未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶；在術(shù)后42天及術(shù)后60天，肝臟接種部位已形成巨大腫瘤，肺上小的出血