Stat3在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其反義靶向治療的研究.pdf

1、第一部分 2’-MOE修飾反義Stat3寡核苷酸對(duì)高侵襲性人肝癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制研究 本實(shí)驗(yàn)主旨在于研究2’-MOE修飾的反義Stat3寡核苷酸特異抑制高侵襲性人肝癌細(xì)胞系HCCLM3中Stat3表達(dá)的規(guī)律，觀察其對(duì)該細(xì)胞系增殖、體外侵襲、誘導(dǎo)血管生成等潛能的作用，并利用cDNA微陣列技術(shù)探討其相關(guān)的分子機(jī)制，為該藥物的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為深入理解肝癌生成、進(jìn)展的機(jī)制提供新的思路。 1．反義Stat3寡核苷

2、酸特異抑制HCCLM3細(xì)胞Stat3表達(dá)的規(guī)律： 采用Lipofectamine<'TM> 2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑作為載體(寡核苷酸：脂質(zhì)體=1∶2(w/v))，以空白載體為對(duì)照，分別以2’-MOE修飾的反義Stat3寡核苷酸(Stat3 ASO，ISIS-113176-3)、隨機(jī)序列寡核苷酸 (BRC oligon.，ISIS-29848-11)轉(zhuǎn)染 HCCLM3細(xì)胞。分別應(yīng)用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞

3、Stat3 mRNA以及Stat3蛋白、磷酸化Stat3(Try705)蛋白表達(dá)水平的變化。 2．反義Stat3寡核苷酸對(duì)細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響： 用相差顯微鏡以及電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染Stat3 ASO或BRC oligon．細(xì)胞的形態(tài)以及超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Stat3 ASO和陽(yáng)離子脂質(zhì)體形成直徑約300 nm的單層脂質(zhì)體復(fù)合物，以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞。Stat3 ASO能夠特異地引起線粒體嵴減少。 3．反義Sta

4、t3寡核苷酸對(duì)細(xì)胞增殖、成瘤性、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響及其可能分子機(jī)制： 采用MTT法、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖、體內(nèi)成瘤性的影響，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Stat3 ASO以劑量依賴的方式特異抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖，并且其抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)在48h達(dá)到高峰；Stat3 ASO預(yù)處理(250 nM，24h)的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性減弱以及增長(zhǎng)緩慢。250 nM Stat3 ASO處理細(xì)胞24h

5、，引起細(xì)胞周期S/G2-M期阻滯、誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡(43.6±1.83％)?；蛐酒l(fā)現(xiàn)Stat3 ASO下調(diào)了細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)相關(guān)的關(guān)鍵基因BRCA1、BRCA2、cyclin D1、p16ink4、CDC25a、cdk4，p21Waf1等，下調(diào)了與凋亡有關(guān)的基因Apaf-1、bax、bcl-2、bcl-x、survivin等，并上調(diào) Fas(Apo-1)的表達(dá)。多基因的變化導(dǎo)致其上述效應(yīng)。 4．反義Stat3寡核苷

6、酸對(duì)細(xì)胞體外侵襲能力的影響及其可能分子機(jī)制： Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)；250 nM Stat3 ASO處理細(xì)胞24h能夠特異抑制細(xì)胞體外侵襲活性。明膠酶譜法測(cè)定顯示：轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP2、MMP9 的分泌水平顯著降低，Stat3 ASO特異下調(diào)HCCLM3細(xì)胞分泌MMP2、MMP9，尤其是MMP2?；蛐酒Y(jié)果顯示：Stat3 ASO下調(diào)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因MMP-2、MMP-9、KISS1、Nm23-E4等，以及與

7、粘附相關(guān)的基因Integrinα5、Integrinα 3、CD44、MUC-18、Integrin β3；并上調(diào)TIMP1。這些基因綜合的影響結(jié)果導(dǎo)致肝癌細(xì)胞體外侵襲能力的下降。 5．反義Stat3寡核苷酸對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成能力的影響及其可能分子機(jī)制： 裸鼠皮內(nèi)腫瘤血管形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Stat3 ASO顯著抑制了HCCLM3誘導(dǎo)血管生成的能力；RT-PCR和ELISA的方法顯示：VEGF121；VEGF165；VEGF1

8、89三種VEGF同源體的表達(dá)顯著下調(diào)?；蛐酒M(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：與血管形成相關(guān)的基因如ANGPT2、EGFR、FGF2、IFNA1、IGF-1、PDGFα、thrombospondin2、VEGF等顯著下調(diào)。 另外，akt-1、erb-2、MEK1、β-catenin、c-fos等基因的下調(diào)表達(dá)可能參與了上述多個(gè)過程。 綜上所述，2’-MOE修飾的反義Stat3寡核苷酸特異抑制Stat3的表達(dá)，并影響多基因表達(dá)譜的改變，進(jìn)而有

9、效抑制了肝癌的生長(zhǎng)、侵襲、血管生成能力。說明反義Stat3寡核苷酸藥物是有潛力的抗肝癌治療的藥物。也從另外角度提示Stat3信號(hào)通路可能通過調(diào)控多種腫瘤發(fā)生相關(guān)基因而影響肝癌的進(jìn)展。因而為肝癌分子機(jī)制的研究提供了新的思路。 第二部分 2’-MOE修飾反義Stat3寡核苷酸抑制肝癌生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究 本部分研究目的在于探討體內(nèi)應(yīng)用2’-MOE修飾的反義Stat3寡核苷酸對(duì)有高侵襲潛能肝癌的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移的作用，評(píng)價(jià)其

10、作為抗肝癌治療藥物的應(yīng)用價(jià)值。 建立90只裸鼠原位種植HCCLM3肝癌模型，并隨機(jī)平均分為兩大組。各大組隨機(jī)分為三實(shí)驗(yàn)組(n=15)，分別設(shè)為：生理鹽水(NS)對(duì)照組(G1)、隨機(jī)序列寡核苷酸(BRC oligon．)對(duì)照組(G2)、反義Stat3寡核苷酸(Stat3 ASO，ISIS-113176-3) 治療組(G3)。方案一(E1)：其中一大組裸鼠于原位種植腫瘤后第2天開始治療，E1G1組NS 0.2ml i．p．，E1G2

11、組50mg/kg BRC oligon．ip．，E1G3組50mg/kg Stat3 ASO i．p．，均隔兩天注射一次；連續(xù)注射9次后，改為隔一天注射一次，注射3次；方案二(E2)：另一大組裸鼠于種植腫瘤后第10天開始治療，E2G1組NS 0.2ml i．p．，E2G2組50mg/kg BRC oligon．ip．，E2G3組50mg/kg Stat3 ASO i.p.，均隔一天注射一次，注射12次。最后一次給藥后第三天(即第35天時(shí)

12、)，各組隨機(jī)選擇9只裸鼠解剖觀察肝癌生長(zhǎng)和腹腔轉(zhuǎn)移情況；免疫組化檢測(cè)Stat3表達(dá)；抗小鼠CD34抗體標(biāo)記肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)；采用連續(xù)切片法檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目；ELISA法測(cè)定裸鼠血清中VEGF和bFGF的含量；常規(guī)檢驗(yàn)血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)以及轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)等。各組中另6只裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)以觀察生存時(shí)間。 我們獲得了至少四方面有意義的結(jié)果： 1.體內(nèi)應(yīng)用反義Stat3寡核苷酸有效抑制肝癌的生長(zhǎng)、侵襲

13、轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)荷瘤鼠生存期： 兩種用藥方案，反義Stat3寡核苷酸均能夠特異地抑制Stat3蛋白的表達(dá)，并有效抑制肝癌的生長(zhǎng)、局部轉(zhuǎn)移(肝內(nèi)、腹腔、膈肌等)和肺轉(zhuǎn)移。方案一中反義Stat3寡核苷酸治療組(E1G3)瘤重為0.93±O.12g，明顯低于生理鹽水對(duì)照組(E1G1)1.73±0.17g(P<0.01)和隨機(jī)序列寡核苷酸組(E1G2)1.67±0.27g(P<0.01)。E1G3組未見肺轉(zhuǎn)移，而E1G1組和E1G2組肺轉(zhuǎn)移率

14、分別為100％和89％ (P<0.001)。E1G3組荷瘤裸鼠的生存期顯著長(zhǎng)于E1G1組(101±14.6天vs 49.0±4.9天，P<0.001)和E1G2組(101±14.6天 vs 52.7±6.7天，P<0.001)。方案二中反義Stat3寡核苷酸治療組(E2G3)瘤重為1.18±0.11g，也明顯低于生理鹽水對(duì)照組(E2G1)1.89±0.24g(P<0.01)和隨機(jī)序列寡核苷酸組(E2G2)1.77±0.39g(P<0.0

15、1)。E2G3組肺轉(zhuǎn)移率為22％，而E2G1組、E2G2組的肺轉(zhuǎn)移率皆為100％(P<0.01)。 2.體內(nèi)應(yīng)用反義Stat3寡核苷酸有效抑制肝癌血管生成： 兩種治療方案中，反義Stat3寡核苷酸均能有效抑制肝癌血管生成，E1G3組微血管密度顯著低于E1G1組(3.3±1.5 vs.15.2±3.4；P<0.01)和E1G2組(3.3±1.5 vs.13.8±4.0；P<0.01)；E2G3組微血管密度也明顯低于E2G1

16、組(4.0±1.8vs.16.8±1.7：P<0.01)和E2G2組 (4.0±1.8 vs.14.5±4.0；P<0.01)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：反義Stat3寡核苷酸明顯抑制了荷瘤裸鼠血清中VEGF和bFGF的表達(dá)水平(P<0.01)。上述結(jié)果表明：通過下調(diào)VEGF和bFGF等促血管生成因子的表達(dá)而抑制血管生成可能是反義Stat3寡核苷酸抑制肝癌在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。 3.腫瘤負(fù)荷影響反義Stat3寡核苷酸的療

17、效： 早期給予反義Stat3寡核苷酸治療(E1G3組)比后期給予反義Stat3寡核苷酸治療(E2G3組)更為有效地抑制肝癌生長(zhǎng)(瘤重0.93±0.12g vs.1.18±0.11g；P<0.05)、肺轉(zhuǎn)移(0/9 vs 2/9；P<0.05)、以及延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存期(101±14.6天vs.82.3±11.1天；P<0.05)，但兩組在Stat3蛋白表達(dá)、血清VEGF、bFGF含量和微血管密度等方面未見明顯差別。 4.體