下調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路中STAT3的表達(dá)在食管鱗癌發(fā)生和治療中的作用.pdf

1、目的：食管癌是胃腸道中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在中國(guó)，食管癌被認(rèn)為是第四大最致命的癌癥，對(duì)人類的身心健康存在著嚴(yán)重的威脅。食管癌的病理類型主要有兩種，即食管鱗癌和食管腺癌。在我國(guó)，食管鱗癌是最主要的食管癌類型，大約占90％以上。食管鱗癌的發(fā)生以及發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜多變的過(guò)程。與其它惡性腫瘤一樣，食管鱗癌的發(fā)生是由多種基因、多種因素相互作用的結(jié)果，而且其發(fā)病機(jī)制也是一個(gè)多階段的發(fā)展過(guò)程，但其分子機(jī)制尚不清楚，在診斷和治療上也缺乏有效的手段。

2、隨著腫瘤分子靶向治療的不斷進(jìn)展，深入研究食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制，以及尋找新的腫瘤治療靶標(biāo)與標(biāo)志物將具有非常重要的意義。
　　信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是Fu等人在1992年研究干擾素誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)首次鑒定的一個(gè)蛋白家族。STAT蛋白家族成員，參與了各種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成、細(xì)胞凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和免

3、疫逃避。目前已發(fā)現(xiàn)STAT家族存在7個(gè)成員，包括STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。
　　作為STAT蛋白的家族成員之一，在人體中STAT3編碼基因定位于第12號(hào)染色體上，是于1994年作為IL-6信號(hào)傳遞中的急性期反應(yīng)因子而被純化的。STAT3廣泛地存在于不同類型的細(xì)胞和組織中，最初發(fā)現(xiàn)STAT3與腫瘤的關(guān)系是在v-Src轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了STAT3信號(hào)通路的激活，活化的ST

4、AT3蛋白突變體能轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，最終使小鼠致癌；而阻斷STAT3信號(hào)后，成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化則受到抑制。在多發(fā)性骨髓瘤和頭頸部腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了激活的STAT3信號(hào)，首次揭示了STAT3與人類惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。己有較多文獻(xiàn)報(bào)道了STAT3在頭頸部腫瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌以及胃癌等多種惡性腫瘤中存在異常的表達(dá)，并參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　STAT3在多種人體腫瘤中存在異常的表達(dá)，而阻斷ST

5、AT3信號(hào)通路能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。隨著對(duì)STAT3信號(hào)通路研究的不斷深入，STAT3信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色越來(lái)越受到重視，以STAT3為靶點(diǎn)的治療策略有望為某些惡性腫瘤的治療開(kāi)辟出一條新的途徑。本文以小分子抑制劑stattic作為抑制STAT3磷酸化的藥物，以研究STAT3在食管鱗癌的發(fā)生及發(fā)展中的作用。
　　第一部分、阻斷STAT3信號(hào)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖和抗凋亡的影響
　　方法

6、:
　　1.利用Western blotting檢測(cè)多種不同來(lái)源的食管鱗癌細(xì)胞株中p-STAT3的激活情況。
　　2.利用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度（DMSO、1、3、10和30μM）的stattic在24h和48h對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的毒性作用，并篩選出用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的stattic濃度。
　　3.根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選取用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的最大藥物濃度，設(shè)置細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的stattic濃度（DMSO、1、2、3和4μM）

7、，檢測(cè)不同濃度的stattic在不同時(shí)間點(diǎn)（0、24、48、72和96h）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖抑制作用，并觀察其抑制作用與STAT3表達(dá)是否相關(guān)。
　　4.利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度stattic（DMSO、1、2、3和4μM）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的克隆形成能力的影響。
　　5.利用Western blotting檢測(cè)不同濃度（DMSO、5、10和20μM）stattic對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中的STAT3及相關(guān)基因表達(dá)的影響。<

8、br>　　6.利用Western blotting檢測(cè)不同濃度（DMSO、5、10和20μM）stattic+IL-6（30ng/ml）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中的STAT3活化及阻斷情況的影響。
　　7.利用Annexin V、PI和Hoechst合染以及DAPI染色來(lái)檢測(cè)不同濃度的stattic（DMSO、1、2、3和4μM）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡及周期的影響。
　　結(jié)果:
　　1.在多例食管鱗癌細(xì)胞系中，STAT3均呈現(xiàn)出不同

9、程度的表達(dá)，但是其磷酸化水平存在差異，Eca109、EC9706、TE1、TE13和KYSE450中都呈現(xiàn)出STAT3異常的激活狀態(tài)，而EC1、KYSE70和KYSE140中無(wú)STAT3的磷酸化。
　　2.stattic對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的毒性作用很明顯，并抑制STAT3組成型激活的食管鱗癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制能力隨著stattic的藥物濃度增加而增強(qiáng)。
　　3.在無(wú)毒性的作用濃度下，stattic不能抑制無(wú)STAT3組成型激

10、活的食管鱗癌細(xì)胞的增殖。
　　4.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在具有STAT3組成型激活的食管鱗癌細(xì)胞中，隨著stattic藥物濃度的增加，細(xì)胞克隆數(shù)量減少。
　　5.stattic可抑制STAT3的磷酸化及Cox2的表達(dá)，上調(diào)NOS和Pentraxin3的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)作用顯現(xiàn)出了藥物濃度依賴的趨勢(shì)。
　　6.IL-6可激活食管鱗癌細(xì)胞中STAT3，而stattic可終止這種激活作用，且這種調(diào)節(jié)作用與stattic的

11、作用濃度有依賴關(guān)系。
　　7.Stattic可以促進(jìn)具有STAT3組成型激活的食管鱗癌細(xì)胞（EC9706）的凋亡，并將其細(xì)胞周期阻斷在S期。
　　第二部分、阻斷STAT3信號(hào)在食管鱗癌PDX模型移植瘤小鼠中的治療作用
　　方法:
　　1.利用Western blotting檢測(cè)多例食管鱗癌組織中STAT3的激活狀況。
　　2.篩選出STAT3高磷酸化的食管鱗癌組織（EG30），用SCID小鼠PDX模型檢測(cè)S

12、TAT3抑制劑stattic和化療藥物5-FU的抗癌效果。
　　3.采用Western blotting檢測(cè)stattic和5-FU單獨(dú)或聯(lián)合治療對(duì)腫瘤組織中STAT3信號(hào)通路及iNOS、Cox2和Pentraxin-3表達(dá)的影響。
　　4.通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)stattic和5-FU單獨(dú)或聯(lián)合治療對(duì)腫瘤組織中目標(biāo)蛋白p-STAT3、Cox2、Pentraxin-3和caspase-3表達(dá)的影響。
　　5.利用TUNE

13、L試劑盒檢測(cè)stattic和5-FU單獨(dú)或聯(lián)合治療后，腫瘤組織中細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.在STAT3組成型激活的食管鱗癌異種移植瘤小鼠中，stattic可顯著抑制小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)，而化療藥物5-FU呈現(xiàn)出了耐藥性，療效并不顯著；但當(dāng)5-FU聯(lián)合stattic時(shí)，與stattic單獨(dú)治療組相比，其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。
　　2.在腫瘤組織中，stattic治療組中STAT3和Cox2的激活水平下降，但

14、iNOS和Pentraxin3的表達(dá)增強(qiáng)。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示，stattic可以下調(diào)STAT3的磷酸化水平及Cox2的表達(dá)，并促進(jìn)NOS和Pentraxin3的表達(dá)。
　　4.TUNEL結(jié)果表明，在STAT3組成型激活的食管鱗癌中，stattic可以顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而5-FU聯(lián)合stattic時(shí)會(huì)導(dǎo)致更為顯著的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.在食管鱗癌細(xì)胞系及腫瘤組織中普遍存在STAT3信號(hào)通路的