STAT3信號通路在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，嚴重危害人類健康。由于膠質(zhì)瘤侵襲性生長，極易術(shù)后復(fù)發(fā)，綜合治療效果不佳。目前研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤在多個基因的不同環(huán)節(jié)上發(fā)生異常，膠質(zhì)瘤細胞在增殖、分化和凋亡等重要生物學(xué)過程中缺乏正常的基因調(diào)控而出現(xiàn)細胞的惡性增殖和侵襲生長。新的抗腫瘤治療策略傾向于尋找能夠針對腫瘤機制中不同環(huán)節(jié)同時作用的治療方法，以獲得更好的療效。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (Signal Transducer and Activator of T

2、ranscription 3，STAT3)的發(fā)現(xiàn)為這種設(shè)想供了理論依據(jù)。STAT3介導(dǎo)各種細胞因子和生長因子所引起的廣泛的細胞反應(yīng)，作用涉及細胞的增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)等許多方面，研究在多種人類惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了STAT3 信號通路異常激活的現(xiàn)象，STAT3 的異常激活能夠通過生長因子信號系統(tǒng)與凋亡相關(guān)因子、促血管新生因子等相互作用而導(dǎo)致腫瘤生成并促進腫瘤的發(fā)展。以STAT3作為抗腫瘤治療靶點的重要價值已逐步呈現(xiàn)出來。人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫

3、瘤由于生長部位和組織來源的特殊，具有不同的生物學(xué)特點?；蛑委煹闹匾獌r值尤為明顯。雖然有資料表明人腦膠質(zhì)細胞瘤中有STAT3的異常表達，但對STAT3信號通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及阻斷STAT3信號通路對膠質(zhì)瘤的影響的研究尚未深入開展，相關(guān)機制不明。 研究目的和思路： 本項目擬觀察STAT3在膠質(zhì)瘤手術(shù)切除標(biāo)本及體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞株中的表達，并應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑AG490阻斷STAT3信號通路，觀察腫瘤細胞增殖、

4、凋亡、侵襲等重要生物學(xué)過程發(fā)生的變化，以了解STAT3信號通路在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用，并為這一通路能否成為膠質(zhì)瘤治療的有效靶點作一些前期的評估。 方法和結(jié)果： 一STAT3在星形細胞瘤手術(shù)標(biāo)本中的表達特點星形細胞瘤手術(shù)標(biāo)本30例行HE染色和STAT3免疫組化染色。對照HE染色切片情況，將 STAT3 免疫組化的切片根據(jù)其中陽性細胞的表達強度和分布范圍分別進行評分量化。數(shù)據(jù)行等級資料非參數(shù)檢驗(Nonpara

5、metric Test)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白在所有標(biāo)本中的表達率為100％。STAT3 抗原通常定位在細胞的胞漿部分。STAT3免疫組化染色切片與相應(yīng)的HE染色切片對比，發(fā)現(xiàn)STAT3在瘤周組織正常組織中的表達通常較低或不表達。分化較好的標(biāo)本中，STAT3 蛋白在瘤內(nèi)組織中的表達比較均勻。分化較差的標(biāo)本中，STAT3陽性細胞分布和表達強度上差異很大。部分瘤巨細胞和分裂相的腫瘤細胞胞漿中見到STAT3 的表達。較為惡性的膠質(zhì)

6、瘤內(nèi)常有豐富的新生血管，STAT3蛋白在新生血管的內(nèi)皮細胞中表達不僅非常明確，而且十分普遍。統(tǒng)計結(jié)果顯示STAT3的表達在性別、年齡、病理級別的不同分組間P值大于0.05，無顯著性差異。STAT3在瘤內(nèi)與瘤周組織的表達P<0.01，差異顯著。因此，STAT3 蛋白在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中有廣泛的表達，但瘤周組織表達很低。STAT3在分裂相細胞和腫瘤多核巨細胞及血管內(nèi)皮細胞中的高表達提示STAT3參與了膠質(zhì)瘤細胞分裂、增殖和血管新生關(guān)系密切。

7、 二STAT3、p-STAT3 在人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87中的表達體外培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細胞，將人膠質(zhì)瘤細胞株U251、U87細胞種植于25cm<'2>細胞培養(yǎng)瓶，加含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5％CO<,2> 37℃恒溫的條件下培養(yǎng)。用免疫細胞化學(xué)染色方法以及相差熒光顯微鏡觀察檢測 STAT3 和 p-STAT3在人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251 和 U87中的表達。 結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細胞株U251 和 U87

8、中，STAT3 蛋白和STAT3的激活狀態(tài) p-STAT3都有表達；STAT3蛋白在腫瘤細胞的胞漿表達非常豐富；p-STAT3 蛋白僅表達于腫瘤細胞核；提示STAT3存在于胞漿，磷酸化激活后轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)實施轉(zhuǎn)錄。 三 AG490 對 STAT3 信號通路的阻斷作用以酪氨酸激酶抑制劑AG490阻斷STAT3信號通路，膠質(zhì)瘤細胞 U251、U87接種于6孔板，加入AG490使最終濃度分別達到 12.5uM，25uM，50uM，以不加

9、藥為對照。加藥后腫瘤細胞與對照在條件完全相同的情況下培養(yǎng)72小時。提取細胞總蛋白，通過蛋白定量檢測蛋白濃度，Western Blot半定量的方法檢測STAT3和p-STAT3的表達情況。 結(jié)果顯示：STAT3和p-STAT3在兩種膠質(zhì)瘤細胞株中都有表達，U251 細胞中的表達比U87細胞稍高。STAT3蛋白的表達不受AG490作用的影響，而p-STAT3蛋白的表達在兩種細胞中都隨AG490濃度的升高而逐步降低。U87細胞中STA

10、T3和p-STAT3的表達較低，AG490作用后，p-STAT3的下降更為徹底，甚至完全不表達。 所以，AG490能夠阻斷STAT3信號通路，其機制是通過抑制STAT3蛋白激活形成p-STAT3的過程來阻斷這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。AG490對膠質(zhì)瘤細胞株STAT3信號通路阻斷的效果呈現(xiàn)濃度依賴的特點，并受到腫瘤細胞中STAT3和p-STAT3基礎(chǔ)表達量的影響。四 AG490阻斷STAT3信號通路對膠質(zhì)瘤細胞增殖和存活率的影響將膠質(zhì)瘤細

11、胞接種于96孔板，加入 AG490，使終濃度分別為12.5uM，25uM，50uM，將不加藥組設(shè)為對照。各組細胞在相同條件下培養(yǎng)，分別在加藥前后24小時、48小時和72小時用SRB法染色，通過酶標(biāo)儀570nm比色，對STY3信號通路阻斷的細胞模型進行細胞增殖檢測，并以Excel和SPSS軟件計算和統(tǒng)計分析。 五AG490阻斷STAT3信號通路對膠質(zhì)瘤細胞株凋亡的誘導(dǎo)作用用6孔板培養(yǎng)U251和U87細胞，加入AG490，使終濃度分

12、別為12.5uM，25uM，50uM，設(shè)不加藥組對照。相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在加藥后48小時和72小時收獲細胞。按 Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒說明進行染色，以流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。 發(fā)現(xiàn)：U251、U87細胞在不同濃度AG490作用后，部分腫瘤細胞發(fā)生形態(tài)改變。顯微鏡下表現(xiàn)為胞體縮小，呈圓形突起，細胞周邊在顯微鏡下可見折光。部分凋亡細胞外形膨大，細胞漿呈泡沫樣改變，甚至出現(xiàn)細胞破碎崩解。無論AG490作

13、用48小時還是72小時，U251細胞組和U87細胞組的凋亡比例都高于對照組。在AG490作用的兩種細胞中，腫瘤細胞的凋亡比例均隨AG490濃度的提高而升高。 因此，AG490阻斷STAT3信號通路能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞株發(fā)生凋亡。而大量腫瘤細胞凋亡的發(fā)生可以解釋腫瘤細胞存活率下降的現(xiàn)象。 六．AG490阻斷STY3信號通路對膠質(zhì)瘤細胞株細胞周期的阻滯作用在AG490阻斷STY3信號通路的細胞模型上，用低滲緩沖液對待測細胞行P

14、I染色，用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的DNA細胞周期。 檢測發(fā)現(xiàn)，兩種膠質(zhì)瘤細胞的G1-S期比例增大，而細胞周期其他構(gòu)成部分的比例均下降，提示STAT3信號通路阻斷后膠質(zhì)瘤細胞的分裂過程受到阻滯而停留于分裂前的合成期。 可見，AG490 阻斷 STAT3 信號通路對膠質(zhì)瘤細胞株的細胞周期有阻滯作用。細胞周期的抑制是造成腫瘤細胞增殖抑制的一個重要原因。 七阻斷STAT3信號通路對膠質(zhì)瘤細胞株侵襲性特征的影響通過Tran

15、swe11細胞侵襲試驗檢查阻斷STAT3信號通路對膠質(zhì)瘤細胞株侵襲性特征的影響。以24孔板為基座，采用直徑6.5mm的Transwe11小室，聚碳酸酯微孔膜孔徑8um。使用前鋪Matrigel Matrix及濕化小室。5×10<'4>個膠質(zhì)瘤細胞加入上室，條件培養(yǎng)液及AG490加入下室。以不加藥為對照。繼續(xù)培養(yǎng)10小時后將穿過微孔膜的細胞用Giemsa溶液染色。顯微鏡下細胞計數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果顯示AG490作用后MMP-

16、2和MMP-9的表達與對照組相比均有明顯下降，且下降程度隨AG490濃度的提高而加重。 因此，AG490阻斷STAT3信號通路對膠質(zhì)瘤細胞株體外侵襲力的抑制作用可能是通過下調(diào)MMP-2、MMP-9來實現(xiàn)的。 八AG490阻斷膠質(zhì)瘤細胞STAT3信號通路對部分基因mRNA表達的影響通過RT-PCR觀察AG490阻斷膠質(zhì)瘤細胞STAT3信號通路對部分基因mRNA表達的影響。用6孔板培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞。分別加入AG490達到25u

17、M和50uM的最終濃度，以不加藥組對照，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72小時。用TRIZOL提取細胞總RNA，經(jīng)濃度檢測后用RT方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用MasterMix在PCR擴增儀上擴增。瓊脂糖電泳顯示結(jié)果。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗凋亡因子Mcl-1、Bcl-xL、Survivin的mRNA在AG490作用后表達受到抑制。促進腫瘤血管發(fā)生和侵襲的VEGF表達下降。細胞周期相關(guān)的Cyclin D1有下降趨勢而p21沒有明顯變化。STAT