Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路抑制人腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)研究.pdf

1、人腦膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤占顱內(nèi)腫瘤的近50％。雖然近年來(lái)手術(shù)及術(shù)后的放療和化療取得了很大的進(jìn)步，但不幸的是，其確診后的生存期仍然讓人失望，只有12-15個(gè)月。因此，新的治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的方法在改善預(yù)后和病人生活質(zhì)量方面極需提高。到目前為止，人們普遍認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多種基因參與、多環(huán)節(jié)、多階段、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。所以僅僅干預(yù)一個(gè)腫瘤相關(guān)基因很難達(dá)到治療膠質(zhì)瘤的目的。近年來(lái)，一些轉(zhuǎn)錄因子被逐漸發(fā)現(xiàn)，

2、它們?cè)谡{(diào)節(jié)多個(gè)腫瘤相關(guān)基因方面起重要作用。換句話說(shuō)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以看作是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的總開關(guān)。因此，靶向性阻斷某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子治療腫瘤越來(lái)越受到人們的關(guān)注，也逐漸成為治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)新策略。 信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3，Signal Transducers and Activators of Transcription3）是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路JAK2/STAT3途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，存在于胞漿，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，細(xì)胞的正常

3、生長(zhǎng)、分化和惡變等過(guò)程。持續(xù)活化的STAT3能夠調(diào)控許多腫瘤發(fā)生的環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞周期，凋亡，腫瘤血管形成及腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)等。因此它被看作癌基因并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)阻斷STAT3通路后可以使腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡增加。這些都為STAT3作為分子靶點(diǎn)治療膠質(zhì)瘤提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。 到目前為止，已經(jīng)有幾種阻斷STAT3通路的策略，包括顯性負(fù)性調(diào)節(jié)，反義核苷酸，RNA干擾技術(shù)，生化制劑，雙鏈或單鏈誘騙寡核苷酸技術(shù)。誘騙寡核苷酸技術(shù)（

4、decoy oligodeoxynucleotide，Decoy-ODN），將體外人工合成，有高度親和性，并且模擬目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子靶基因上啟動(dòng)子順式元件的序列合成的小分子“誘騙”DNA，轉(zhuǎn)染導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制靶基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，降低其轉(zhuǎn)錄活性，阻止這些致癌基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導(dǎo)凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。由于它的高效，低成本和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，誘騙寡核苷酸技術(shù)廣泛地應(yīng)用于包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和頭頸部鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤的研究

5、。結(jié)果顯示，阻斷STAT3通路后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著受到抑制并引起凋亡，然而，對(duì)膠質(zhì)瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)情況的影響卻鮮為人知。本課題旨在研究和探討應(yīng)用Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體內(nèi)效應(yīng)和機(jī)制。研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分。 一、人腦膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中STAT3異常表達(dá)研究 目的: 檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及臨床標(biāo)本中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達(dá)情況，研究人腦膠質(zhì)瘤中STAT3的異常表達(dá)

6、及持續(xù)活化的意義，為針對(duì)STAT3治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、Western印跡方法檢測(cè)60例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和5例正常腦組織標(biāo)本中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達(dá)，并對(duì)其異常表達(dá)及持續(xù)活化的情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2、Western印跡方法檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達(dá)。 結(jié)論: 1、人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中廣泛存在著STAT3的過(guò)高表達(dá)及持續(xù)活化，

7、說(shuō)明STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路在膠質(zhì)瘤中具有重要意義，為抑制STAT3治療膠質(zhì)瘤的研究奠定了基礎(chǔ)。 2、U251細(xì)胞系中存在STAT3及其磷酸化的異常表達(dá)，可以作為本課題的研究對(duì)象。 二、Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的體外研究 目的: 研究陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染STAT3 Decoy-ODN的效果和效率。檢測(cè)Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路對(duì)人腦膠質(zhì)

8、瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。檢測(cè)Decoy-ODN轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)其凋亡的影響。 方法: 1、應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染法將STAT3Decoy-ODN轉(zhuǎn)染導(dǎo)入人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251內(nèi)。 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC標(biāo)記的STAT3 Decoy-ODN在U251中的轉(zhuǎn)染效率。 3、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路后對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的

9、抑制效應(yīng)。 4、Annexin V/PI雙染法檢測(cè)Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路后U251細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)論: 1、應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，能夠?qū)TAT3 Decoy-ODN高效轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)。 2、STAT3 Decoy-ODN在體外能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。 3、STAT3 Decoy-ODN在體外能夠促進(jìn)人腦

10、膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。 三、Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體內(nèi)研究 目的: 評(píng)價(jià)裸鼠皮下種植U251細(xì)胞的效果，評(píng)價(jià)瘤內(nèi)注射Decoy-ODN的效果，檢測(cè)在體內(nèi)Decoy-ODN對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對(duì)其相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)而深入探討在體內(nèi)Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號(hào)通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。 方法:

11、1、皮下注射法將U251細(xì)胞注入4周齡裸鼠右脅腹皮下。 2、觀察約一周時(shí)間，皮下瘤結(jié)節(jié)能明顯觸到后，瘤內(nèi)注射Decoy-ODN并檢測(cè)其在體內(nèi)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 3、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)體內(nèi)STAT3 Decoy-ODN作用人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后對(duì)增殖標(biāo)志物Ki67表達(dá)水平的影響。 4、Tunel法檢測(cè)在體內(nèi)Decoy-ODN對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。 5、RT-PCR檢測(cè)分析在體內(nèi)STAT3 Deco

12、y-ODN對(duì)細(xì)胞周期控制基因和凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響。 6、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)體內(nèi)STAT3 Decoy-ODN對(duì)細(xì)胞周期控制基因和凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)論: 1、U251細(xì)胞能夠在裸鼠體內(nèi)成瘤。 2、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。 3、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。 4、STAT3 De

13、coy-ODN在體內(nèi)能夠顯著誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。 5、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠下調(diào)細(xì)胞周期和抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。 6、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠降低細(xì)胞周期和抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 總之，通過(guò)本研究表明，在體內(nèi)應(yīng)用STAT3 Decoy-ODN能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期和抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)降低細(xì)胞周期和抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。為