RNA干涉抑制hTERT對人腦膠質(zhì)瘤細胞生長影響及機制研究.pdf

1、本文分為三部分： 第一部分：靶向hTERT小片段干涉RNA表達載體的構(gòu)建和表達 目的:構(gòu)建靶向hTERT的小片段RNA(siRNA)表達載體，為研究RNA干涉(RNAi)在哺乳動物細胞內(nèi)抑制靶基因表達奠定基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)siRNA靶點設計的原則運用相關(guān)軟件設計靶序列并合成其表達框，連接入質(zhì)粒載體pRNAT-H1.1/Neo，轉(zhuǎn)染293T細胞，熒光定量RT-PCR和western blot法檢測轉(zhuǎn)染后293T細胞

2、中hTERT表達。 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定證明hTERT siRNA轉(zhuǎn)錄模板完整、正確插入到pRNAT-H1.1/Neo質(zhì)粒中，并篩選出一個抑制hTERT表達效率最高的序列，其hTERT表達僅達22.90％。 結(jié)論:成功構(gòu)建并篩選出一個抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表達載體，為以hTERT為靶點的腫瘤基因治療的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分：靶向hTERT siRaNA慢病毒表達載體的構(gòu)建 目的

3、:通過構(gòu)建靶向人端粒酶催化亞基(hTERT)RNAi慢病毒載體，獲得可供轉(zhuǎn)染的滴度，為下一步研究該基因缺陷在真核細胞中的影響提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)：hTERT設計的兩條互補的單鏈寡核苷酸退火后形成雙鏈插入到pLVTHM質(zhì)粒，生成含RNAi盒的載體，然后與pCMV-dR8.74和pMD2G病毒包裝所必須的元件經(jīng)脂質(zhì)體導入T293細胞，包裝成慢病毒，收集上清濃縮病毒并檢測其滴度。RT-PCR檢測干擾后細胞內(nèi)hTERT表達變化。

4、 結(jié)果:將目的序列成功連接到載體上，并經(jīng)測序分析證實載體構(gòu)建成功；成功包裝成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP檢測結(jié)果證實構(gòu)建的hTERT-siRNA慢病毒表達載體可顯著抑制hTERT基因的表達和端粒酶活性。 結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶靶向hTERT基因的RNAi慢病毒載體。該載體能夠有效抑制hTERT的表達和端粒酶活性，為以hTERT為靶點的膠質(zhì)瘤基因治療的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分：慢病毒介導的RNAi技術(shù)抑制

5、hTERT表達對U87膠質(zhì)瘤細胞的作用研究 目的:觀測利用RNAi技術(shù)下調(diào)hTERT表達對U87人腦膠質(zhì)瘤細胞的影響。 方法:將慢病毒為載體的靶向hTERT siRNA構(gòu)建體-Lt-I感染u87細胞，含無效序列的慢病毒Lt-non作為空載對照，正常培養(yǎng)U87細胞作為陰性對照。RT-PCR檢測hTERT表達，TRAP法檢測端粒酶表達，MTT和流式細胞檢測分析細胞增殖和周期變化，熒光原位雜交檢測端粒長度變化，Transwel