蛋白激酶C抑制劑TAM對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討蛋白激酶C(PKC)抑制劑他莫昔芬(tamoxifen,TAM)聯(lián)合X射線對人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、凋亡和放射敏感性的影響及其機(jī)制,構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤裸鼠原位瘤,在體內(nèi)驗證TAM的放射增敏作用。
　　方法：
　　(一)體外實驗1、MTT法檢測不同TAM濃度、不同處理時間腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的增殖變化;2、劃痕實驗觀察腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的遷移能力;3、克隆形成實驗檢測TAM對

2、腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的放射敏感性的影響;4、流式細(xì)胞儀測定TAM聯(lián)合X射線對腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的周期分布和細(xì)胞凋亡的影響;5、western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　(二)體內(nèi)實驗:構(gòu)建裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位模型,將成瘤的裸鼠隨機(jī)分為對照組、放療組、TAM組、放療+TAM組,每組5只。MRI評估原位瘤裸鼠腫瘤體積大小,處死裸鼠取瘤組織,免疫組化檢測瘤組織中與凋亡相關(guān)的蛋白Bad的變化。

3、　　結(jié)果：
　　(一)體外實驗:1、TAM可顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的增殖,當(dāng)TAM濃度為10μmo l/L時,A172細(xì)胞的存活率為95.1％,U251細(xì)胞的存活率為93.9％,且與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義,因此后續(xù)實驗研究選擇10μmo l/L藥物濃度作為實驗濃度。2、細(xì)胞劃痕實驗顯示TAM聯(lián)合X射線可顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的遷移能力。3、TAM聯(lián)合 X射線照射作用腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞時,細(xì)胞克隆存活率

4、隨照射劑量的增加而減少(p<0.01),多靶單擊模型擬合劑量存活曲線,A172細(xì)胞單純照射組的平均致死劑量(D0)和準(zhǔn)閾劑量(Dq)分別2.46Gy和2.97Gy,照射+TAM組的D0和Dq分別為1.97Gy和2.80Gy,A172細(xì)胞的放射增敏比(SER)為1.25;U251細(xì)胞單純照射組的D0和Dq分別為2.60Gy和0.91Gy,照射+TAM組的D0和Dq分別為1.78Gy和1.34Gy,U251細(xì)胞的放射增敏比(SER)為1.4

5、6。4、TAM聯(lián)合 X射線使人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯且不可逆轉(zhuǎn)。5、TAM聯(lián)合X射線可顯著增加人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的凋亡率(p<0.01)。6、western-blot結(jié)果顯示,TAM聯(lián)合 X射線作用腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞能顯著抑制PKCι和Cdk7的活性,周期蛋白cyclinB1的表達(dá)減少,而凋亡蛋白Bad的表達(dá)明顯增加,caspase3的活性增加,PARP的活性降低。
　　(二)體

6、內(nèi)試驗:1、構(gòu)建原位腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的荷瘤鼠模型,MRI檢查結(jié)果顯示照射+TAM組腫瘤體積比其他實驗組腫瘤體積明顯小,免疫組化顯示照射+TAM組腫瘤組織Bad表達(dá)增高。
　　結(jié)論：
　　(1)TAM能明顯抑制人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的增殖,呈濃度和作用時間依賴性;(2)TAM聯(lián)合 X射線能顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的遷移能力,TAM能增加人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的放射敏感性;(3)TAM聯(lián)合