異甘草素對SHG44人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究不同濃度的異甘草素對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療敏感性的影響及作用機(jī)制，為異甘草素作為放療增敏劑治療人腦膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.使用超低吸附懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板，通過無血清條件培養(yǎng)法從SHG44人腦膠質(zhì)瘤貼壁細(xì)胞中提取和純化膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，通過CD133、Nestin聯(lián)合鑒定懸浮細(xì)胞球的干細(xì)胞特性，通過Bcl-2鑒定懸浮細(xì)胞球的膠質(zhì)瘤細(xì)胞源性；
　　2.運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測不同濃度異甘草素和不

2、同劑量X射線的單獨(dú)和聯(lián)合運(yùn)用下膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖活性，并在顯微鏡下觀察和記錄膠質(zhì)瘤干細(xì)胞懸浮球的成球情況。通過細(xì)胞活性和干細(xì)胞懸浮球在形態(tài)上的抑制情況評估異甘草素的放療增敏效果；
　　3.運(yùn)用Western blotting技術(shù)檢測不同濃度異甘草素作用下Notch1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以Notch1信號通路特異性阻斷劑DAPT作為陽性對照。檢測異甘草素預(yù)處理后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對不同劑量X射線照射后NF-κB和凋亡關(guān)鍵蛋白cas

3、pase-3的表達(dá)情況，以此探討異甘草素對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞X射線放療增敏的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.無血清條件培養(yǎng)能夠有效地提取和純化人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞懸浮球，免疫熒光染色CD133和Nestin表達(dá)陽性說明懸浮細(xì)胞球具有干細(xì)胞特性，Bcl-2表達(dá)陽性說明懸浮細(xì)胞球的腫瘤源性；
　　2.72h后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的活性被異甘草素所抑（P＜0.05）。異甘草素處理9天后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的成球能力被抑制,20?M濃度以上的異甘草

4、素能夠明顯降低膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的數(shù)目和干細(xì)胞球的直徑（P＜0.01）。在72h內(nèi)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活性并不隨X射線的照射劑量的增加而有所改變。在9天的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球過程中，雖然X射線能夠一定程度上減小所形成的懸浮細(xì)胞球的直徑（P＜0.01），但是，成球的數(shù)目并沒有因為X射線的照射而下降，表現(xiàn)出X射線的耐受；
　　3.本研究發(fā)現(xiàn)10?M的異甘草素雖然直接抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長的作用有限，但在8Gy較高劑量X射存在的情況下，能夠增加

5、膠質(zhì)瘤放療的敏感性(P＜0.05)，表現(xiàn)為所形成的干細(xì)胞球數(shù)目下降和直徑下降。20?M的異甘草素殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用明顯，且在4Gy的X射線照射時就有較強(qiáng)的增敏效果，在8Gy的X射線下聯(lián)合殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的能力進(jìn)一步提高（P＜0.05）。而40?M以上的異甘草素抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的作用較為明顯，在聯(lián)合X射線干預(yù)下，主要表現(xiàn)出直接抑制增殖的作用；
　　4.Notch1（Notch1信號通路受體）、RBPJK（Notch1信號通路

6、的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）和Hes1（Notch1信號通路的靶基因）的表達(dá)在異甘草素組和DAPT組比對照組顯著下降（P＜0.05），呈一定的劑量依賴效應(yīng)。沒有X射線干預(yù)的情況下，異甘草素組和對照組的P-NF-κB表達(dá)量均較低。4Gy的X射線照射后，異甘草素組P-NF-κB比對照組高（P＜0.05），且X射線照射后6h出就開始表達(dá)增高，24h進(jìn)一步升高（P＜0.05）。沒有X射線干預(yù)的情況下，異甘草素組的cleaved caspase-3表達(dá)比對照

7、組高（P＜0.05），隨著時間推移沒有明顯變化。在4Gy的X射線照射后，未加異甘草素組的cleaved caspase-3表達(dá)比未放射的對照組明顯增高（P＜0.05），但隨著時間的推移未見明顯變化。而4Gy的X射線照射后，異甘草素預(yù)處理組在6h內(nèi)與未放射組相比，cleaved caspase-3表達(dá)沒有明顯改變，而24h后，cleaved caspase-3表達(dá)開始升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞