HOTAIR調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤生長的實驗研究.pdf

1、目的：
　　人腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤的侵襲和復發(fā)率都明顯高于顱內(nèi)其他腫瘤。特別是膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）預后差、易復發(fā)，嚴重影響患者生活和生存質(zhì)量，其中GBM患者中位生存期在1年左右。在當前精準醫(yī)學概念的指導下，傳統(tǒng)的腫瘤分型正逐步轉向以分子遺傳特征為基礎的新診斷體系。癌癥基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas, TCGA）研究結果表明，包括表皮生長因子

2、受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）、β-連環(huán)素（β-catenin）、非編碼RNA HOTAIR為代表的多個癌基因突變、擴增是人腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的重要分子事件。當前觀點認為，Wnt/β-catenin等在內(nèi)的多個信號通路與EGFR信號通路之間的協(xié)同作用和交互調(diào)節(jié)導致膠質(zhì)瘤向快速生長期轉變，也是惡性膠質(zhì)瘤治療失敗的重要原因。因此，尋找膠質(zhì)瘤中EGFRwt/vIII與β-catenin信號

3、通路調(diào)節(jié)關鍵基因及其分子機制，成為影響膠質(zhì)瘤靶向治療效果關鍵所在。
　　方法：
　　1、對中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃（Chinese Glioma Genome Atlas, CGGA）和TCGA提供的人腦膠質(zhì)瘤標本全基因組測序數(shù)據(jù)分析HOTAIR表達；收集整理CGGA提供膠質(zhì)瘤標本的性別、KPS評分等數(shù)據(jù)；隨訪CGGA生存期；焦磷酸測序法檢測CGGA所有標本中異檸檬酸脫氫酶同工酶1（IDH1）和甲基鳥嘌呤甲基轉移酶（MGM

4、T）突變頻率；免疫組織化學染色化學染色法檢測MGMT、人增殖細胞核核抗原（Ki-67）、EGFR、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）表達；Cox回歸分析HOTAIR表達與膠質(zhì)瘤標本臨床特征關系。
　　2、U87人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞經(jīng)表達HOTAIR干擾RNA的慢病毒載體（Lenti-HOTAIR si）侵染48h后，提取總RNA，使用Illumina HiSeqTM2000系統(tǒng)進行測序，篩選差異表達基因。

5、篩選Nemo樣激酶（Nemo-like kinase, NLK）作為HOTAIR靶基因。
　　3、Lenti-HOTAIR si轉染U87和U87vIII細胞，蛋白印跡（Westernblot）檢測Nemo樣激酶（Nemo-like kinase, NLK）表達；染色體免疫共沉淀法檢測免疫共沉淀法檢測HOTAIR調(diào)控NLK轉錄；免疫共沉淀PKM2與β-catenin相互作用；熒光素酶實驗檢測β-catenin信號通路轉錄活性變化；

6、流式細胞術檢測敲低HOTAIR后GBM細胞周期變化；克隆形成實驗、transwell實驗和劃痕實驗檢測GBM侵襲、遷移能力變化；WB檢測細胞周期、上皮間質(zhì)轉化相關蛋白表達變化。
　　4、建立不同HOTAIR表達水平的U87和U87vIII GBM裸鼠顱內(nèi)模型，使用小動物成像系統(tǒng)檢測腫瘤大小；HE染色檢測腫瘤細胞形態(tài)變化，免疫組化檢測Ki-67、NLK、p21等蛋白表達變化。
　　結果：
　　1、通過對CGGA中310例

7、膠質(zhì)瘤和5例正常腦組織標本中HOTAIR表達狀態(tài)的分析顯示，HOTAIR在GBM中表達高于低級別膠質(zhì)瘤（low grade glioma, LGG）和正常腦組織（P<0.05）；Kaplan-Meier生存分析顯示HOTAIR高表達GBM患者生存較差（P<0.05）；單因素回歸分析提示HOTAIR表達與患者確診年齡、MGMT啟動子甲基化相關（P<0.05）；與性別、KPS評分、是否完整切除、MGMT、PTEN、Ki67表達無關（P>0.

8、05）。多因素COX回歸分析提示HOTAIR表達、確診年齡、IDH1突變、KPS評分和Ki67表達等與GBM患者總生存負相關（P<0.05）。
　　2、通過對比是否轉染Lenti-HOTAIR si的U87MG細胞RNA測序結果，我們發(fā)現(xiàn)1288個過表達基因和1628個低表達基因。通過比對CGGA數(shù)據(jù)庫，初步鑒定NLK是HOTAIR下游候選靶基因。NLK表達在高級膠質(zhì)瘤（high grade glioma, HGG）中表達較LGG

9、降低（P<0.05）；就CGGA數(shù)據(jù)庫中GBM標本中HOTAIR與NLK表達負相關（r=0.156, P<0.05）。Western blot證實，敲低HOTAIR表達后，NLK表達升高；CHIP-PCR證實，H3K27me3在NLK5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和轉錄起始位點上游3kb范圍內(nèi)有結合位點，HOTAIR抑制NLK轉錄。
　　3、敲低U87MG和U87vIIIMG細胞中HOTAIR表達后， TOP-FOP熒光素酶實驗證實，

10、β-catenin轉錄活性下調(diào)（P<0.05）；總β-catenin（-p）和組分蛋白β-catenin（-p）表達下調(diào)（P<0.05）；細胞周期阻滯于G1期；RB（-p）、p21和p16表達升高；CyclinD1、E2F1表達降低（P<0.05）；2-D基質(zhì)生長實驗示GBM細胞敲低HOTAIR細胞降解細胞外基質(zhì)、增殖能力下降（P<0.05）；Transwell和劃痕實驗證實敲低HOTAIR后GBM細胞侵襲、遷移能力下降（P<0.05）

11、；Western blott提示E-cadherin表達升高；N-cadherin、NF-κB、ZEB-1、Twist-1表達下降（P<0.05）。
　　4、動物實驗結果提示，敲低HOTAIR表達的U87MG和U87vIIIMG裸鼠顱內(nèi)生存期高于對照組（P<0.05）；小動物成像和HE染色提示Lenti-HOTAIR si轉染組腫瘤體積小于對照組（P<0.05）；IHC檢測提示：敲低HOTAIR表達后， NLK和p21表達升高；K

12、i67、β-catenin、Slug表達降低。
　　結論：
　　綜上所述，本研究首次鑒定膠質(zhì)瘤中非編碼RNA HOTAIR下游靶基因，且初步闡述膠質(zhì)瘤中HOTAIR參與調(diào)控β-catenin信號通路的生物學功能以及作為治療靶點前的前景。具有以下三個重要的理論方法和實踐意義：（1）首次應用通過對比CGGA數(shù)據(jù)庫和體外細胞系中RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出候選靶基因；為今后開展針對LncRNA的基礎研究提供方法學依據(jù)；（2）通過基于