EPCs示蹤膠質(zhì)瘤及對(duì)其生長(zhǎng)影響的MRI研究.pdf

1、背景:
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)起源于中胚層的成血管細(xì)胞，出生后主要存在于骨髓內(nèi)。Asahara等在1997年從外周血中分離出了內(nèi)皮祖細(xì)胞，目前被廣泛接受的是表達(dá)CD34+，CD133+和VEGFR-2+（也稱為KDR或FLK1）的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞可以用貼壁培養(yǎng)、免疫磁珠篩選、流式細(xì)胞儀等方法從骨髓、臍帶血和外周血中分離出來，我課題組一直以來選用貼壁培養(yǎng)法分離大鼠脾臟起源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并取得了較為滿意的效果。惡性膠質(zhì)

2、瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，目前公認(rèn)的治療方法是手術(shù)輔以化療和放療。但是由于GBM常侵犯周圍組織結(jié)構(gòu)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)放化療耐藥性高，從而造成手術(shù)切除率低、術(shù)后復(fù)發(fā)率高，GBM的中位生存時(shí)間僅為14.6個(gè)月。近年來，隨著對(duì)惡性膠質(zhì)瘤研究的進(jìn)一步深入，某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和相關(guān)基因在惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中所起的作用越來越明確，這也讓新的治療方法，即生物靶向治療成為可能。近年來，很多學(xué)者設(shè)想使用某種載體攜帶細(xì)胞因子、自殺基因和溶瘤細(xì)胞基因治療膠

3、質(zhì)瘤，作為生物靶向治療的載體，最基本的要求是其可以將治療基因特異性地帶入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)并使其充分表達(dá)。EPCs可以在多種細(xì)胞因子的趨化作用下從骨髓龕動(dòng)員出來，歸巢至腦內(nèi)膠質(zhì)瘤，并分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤新生血管的形成，這一特征使EPCs攜帶毒性基因、抗癌基因、化療藥物靶向治療膠質(zhì)瘤成為可能。但EPCs歸巢后在膠質(zhì)瘤內(nèi)是如何分布的，是否會(huì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)或?qū)ζ渌飳W(xué)特性造成影響是EPCs作為膠質(zhì)瘤靶向示蹤或治療載體需要解決的關(guān)鍵問題。我

4、們的前期研究結(jié)果顯示，劑量為1×106的EPCs注射入大鼠體內(nèi)，CTP、MVD、腫瘤體積等指標(biāo)證實(shí)EPCs不會(huì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。但EPCs參與膠質(zhì)瘤新生血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，注入模型體內(nèi)EPCs的數(shù)量、不同的觀察時(shí)間點(diǎn)、腫瘤生長(zhǎng)周期以及所用MRI場(chǎng)強(qiáng)等都可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定程度的影響。為了進(jìn)一步證實(shí)外源性EPCs對(duì)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性有無影響，本研究將較高劑量的EPCs注入膠質(zhì)瘤大鼠體內(nèi)，利用超高場(chǎng)強(qiáng)MRI觀察USPIO-EPCs

5、在大鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)部分布的位點(diǎn)及遷移過程，進(jìn)一步明確其示蹤膠質(zhì)瘤的有效性，并通過DSC-EPI、腫瘤體積及病理學(xué)相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)USPIO-EPCs對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和相關(guān)生物學(xué)特性是否會(huì)造成影響。最終，為EPCs作為膠質(zhì)瘤靶向示蹤、抗腫瘤基因或藥物的細(xì)胞載體研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　探討USPIO-EPCs在大鼠原位腦膠質(zhì)瘤內(nèi)的動(dòng)態(tài)歸巢特點(diǎn)及可能的機(jī)制，分析EPCs對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和相關(guān)生物學(xué)特征變化的影響，為EPCs作為膠質(zhì)瘤示蹤

6、、診斷和治療載體提供有效性、可行性和安全性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1.USPIO-EPCs示蹤大鼠原位腦膠質(zhì)瘤及在膠質(zhì)瘤內(nèi)的動(dòng)態(tài)歸巢超高場(chǎng)MRI研究
　　1.1.EPCs的分離、鑒定和培養(yǎng)
　　采用我科方靖琴等的方法。
　　1.2.建立原位C6膠質(zhì)瘤模型和分組
　　將實(shí)驗(yàn)大鼠分為腫瘤組、假腫瘤組和對(duì)照組，剪開大鼠頭皮，刺破顱骨和硬腦膜后，利用立體定向儀向腫瘤組和對(duì)照組注入10ulC6膠質(zhì)瘤

7、細(xì)胞，而假腫瘤組僅注射入等量DPBS，建模后第7天腫瘤組和假腫瘤組經(jīng)大鼠尾靜脈注入劑量為2×106的USPIO-EPCs，對(duì)照組僅注入等量的生理鹽水。
　　1.3.USPIO-EPCs示蹤膠質(zhì)瘤MRI觀察
　　采用7.0T德國(guó)布魯克公同磁共振掃描儀Biospec70/20USR機(jī)型進(jìn)行掃描，掃描序列包括T1WI、T2WI、T2map和SWI序列。分別在注射USPIO-EPCs前、注射1、3、5、7天后在每個(gè)序列上觀察腫瘤內(nèi)部

8、信號(hào)變化情況。在T2map圖像上測(cè)量各組病變區(qū)在不同時(shí)間點(diǎn)的T2值，并繪制時(shí)間—T2map值曲線。
　　1.4.移植EPCs后膠質(zhì)瘤的病理組織學(xué)特征觀察
　　在相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)3組標(biāo)本進(jìn)行取材，用4％多聚甲醛和生理鹽水經(jīng)左心室灌注，取出腦組織后進(jìn)行石蠟包埋后進(jìn)行病理學(xué)分析，用普魯士藍(lán)染色后觀察標(biāo)本內(nèi)是否有陽性的藍(lán)染顆粒及其分布的區(qū)域，對(duì)普魯士藍(lán)染色陽性的標(biāo)本進(jìn)行F4/80染色，觀察有無陽性表達(dá)，以鑒別藍(lán)染的細(xì)胞是吞噬鐵顆粒的巨噬

9、細(xì)胞還是USPIO-EPCs。對(duì)各標(biāo)本進(jìn)行MMP-9、VEGF、SDF-1染色等，觀察標(biāo)本中陽性細(xì)胞的分布情況與普魯士藍(lán)染色陽性細(xì)胞的分布之間是否存在聯(lián)系。
　　2.USPIO-EPCs對(duì)大鼠原位腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)特征影響的超高場(chǎng)動(dòng)態(tài)MRI觀察
　　2.1.C6膠質(zhì)瘤模型的建立和分組
　　在立體定向儀上建立大鼠膠質(zhì)瘤模型后，將大鼠膠質(zhì)瘤模型分為3個(gè)組，待腫瘤生長(zhǎng)至第7天時(shí)，A組大鼠經(jīng)尾靜脈注射入劑量為2×106的USPIO-

10、EPCs，B組大鼠注射劑量為3×106的USPIO-EPCs，對(duì)照組大鼠則只注射入等量的生理鹽水。
　　2.2.腫瘤體積的MRI形態(tài)學(xué)變化
　　3組均在移植EPCs1、3、5、7天后分別進(jìn)行MRI掃描，在T1WI增強(qiáng)序列上測(cè)量腫瘤4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的最大左右徑、前后徑、上下徑，根據(jù)公式左右徑×前后徑×上下徑計(jì)算出腫瘤的體積，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析3組腫瘤在相同時(shí)間點(diǎn)的體積差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3.腫瘤的灌注特征分析
　　

11、在DSC-EPI上得到3組腫瘤4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的灌注圖像，通過image J6.0后處理軟件測(cè)量腫瘤區(qū)域5個(gè)點(diǎn)相應(yīng)的rCBV和MTT數(shù)值，取平均數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察3組腫瘤相同時(shí)間點(diǎn)的血流灌注值有無差異。
　　2.4.腫瘤的病理組織學(xué)特征變化
　　大鼠處死灌注取材后對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行CDTM、MMP-9和VEGF染色，在高倍鏡下(×200)選擇5個(gè)視野對(duì)CD34+染色陽性的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，之后取平均值得到MVD，計(jì)數(shù)微血管標(biāo)準(zhǔn)是每個(gè)

12、染色為棕黃色的細(xì)胞計(jì)數(shù)為一個(gè)血管。除此之外，在微血管密度較高的區(qū)域選用高倍視野(×200)下隨機(jī)測(cè)量5個(gè)血管的最大橫徑，取其平均值為微血管直徑。在高倍鏡下(×200)在MMP-9和VEGF陽性表達(dá)密集的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析3組的病理學(xué)指標(biāo)在相同時(shí)間點(diǎn)的差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.USPIO-EPCs示蹤大鼠原位腦膠質(zhì)瘤結(jié)果及動(dòng)態(tài)歸巢特征
　　1.1.USPIO-EPCs示蹤腦膠質(zhì)瘤的動(dòng)態(tài)MRI表現(xiàn)

13、
　　假腫瘤組移植USPIO-EPCs前后在SWI上均表現(xiàn)為低信號(hào)，T2map—時(shí)間曲線趨于平直，而腫瘤組在移植USPIO-EPCs前顱內(nèi)病變?cè)赟WI上呈等高信號(hào)，移植USPIO-EPCs1天后，腫瘤周邊出現(xiàn)少許點(diǎn)狀低信號(hào)，第3天后SWI上腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)點(diǎn)狀、蜿蜒狀低信號(hào)，主要沿血管分布。移植第5天和第7天后發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)低信號(hào)隨瘤齡的增長(zhǎng)逐漸增多，興趣區(qū)的T2map—時(shí)間曲線呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組腫瘤體積逐漸增大，而其內(nèi)信號(hào)沒有明顯改變。

14、
　　1.2.USPIO-EPCs示蹤腦膠質(zhì)瘤的組織學(xué)特征
　　腫瘤組經(jīng)普魯士藍(lán)染色后也發(fā)現(xiàn)了同MRI一致的現(xiàn)象，假腫瘤組經(jīng)普魯士藍(lán)染色后在腦組織內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)零星分布的藍(lán)染細(xì)胞，對(duì)腫瘤組和假腫瘤組各時(shí)間點(diǎn)的普魯士藍(lán)染色陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)兩組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。由于巨噬細(xì)胞吞噬鐵顆粒后在普魯士藍(lán)染色上也可呈陽性，我們將染色陽性的標(biāo)本用F4/80染色后卻未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，證明藍(lán)染的細(xì)胞是

15、USPIO-EPCs，而非巨噬細(xì)胞。
　　1.3.USPIO-EPCs示蹤腦膠質(zhì)瘤的免疫組化染色
　　腫瘤組在移植USPIO-EPCs1天后腫瘤外周區(qū)有明顯的SDF-1和MMP-9表達(dá)，而腫瘤中央?yún)^(qū)表達(dá)相對(duì)較少;7天后在腫瘤中央?yún)^(qū)及外周區(qū)均有較多的SDF-1和MMP-9染色陽性細(xì)胞分布，其分布基本與普魯士藍(lán)染色陽性的分布情況基本一致，而VEGF染色陽性細(xì)胞僅隨著瘤齡的增長(zhǎng)逐漸增多，一直比較均勻地分布于腫瘤內(nèi)部。
　　2

16、.磁標(biāo)記的外源性EPCs對(duì)大鼠原位腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)影響的動(dòng)態(tài)MRI觀察
　　2.1.不司劑量USPIO-EPCs對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響
　　移植USPIO-EPCs后第1、3、5、7天，3組腫瘤的體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2.不同劑量USPIO-EPCs對(duì)膠質(zhì)瘤MRI灌注的影響
　　DSC-EPI掃描后發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域較對(duì)側(cè)腦組織呈明顯的高灌注，各組的rCBV值隨著瘤齡的增長(zhǎng)逐漸增加，組

17、間相同時(shí)間點(diǎn)的MTT和rCBV的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.3.不同劑量、不同時(shí)相USPIO-EPCs對(duì)膠質(zhì)瘤病理學(xué)特征的影響
　　腫瘤經(jīng)HE染色后在鏡下發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞呈梭形，增長(zhǎng)活躍，排列雜亂無序，與正常腦組織可見—較明顯的邊界，但在交界區(qū)可見腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)入腦組織中。VEGF主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞漿內(nèi)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)也可見少量表達(dá)，MMP-9大多表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿和血管基底膜上，對(duì)3組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的

18、VEGF和MMP-9陽性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)VEGF和MMP-9的陽性表達(dá)數(shù)目在相同時(shí)間點(diǎn)的差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。腫瘤組織經(jīng)CD34+免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)染色陽性的微血管呈蜿蜒狀或環(huán)狀，形態(tài)各異大小不一，分布不均勻。我們通過對(duì)MVD計(jì)數(shù)表明，3組大鼠膠質(zhì)瘤模型的相同時(shí)間點(diǎn)的MVD值差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，3個(gè)組的MVD和rCBV值存在正相關(guān)。3組腫瘤生長(zhǎng)到第14天的微血管直徑為17.25—24.38μm，統(tǒng)

19、計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)微血管直徑在3組的差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、USPIO標(biāo)記的EPCs可以向大鼠膠質(zhì)瘤區(qū)域歸巢，并可以被MRI所檢測(cè)，7.0 T超高場(chǎng)MRI清晰的顯示EPCs早期主要分布在膠質(zhì)瘤外周區(qū)域，隨著瘤齡的增長(zhǎng)逐漸遷移到腫瘤中心區(qū)域。腫瘤組織不同區(qū)域SDF-1和MMP-9表達(dá)變化與USPIO標(biāo)記的EPCs在腫瘤內(nèi)的分布變化有明顯的相關(guān)性，表明SDF-1和MMP-9在腫瘤內(nèi)部表達(dá)分布變化情況

20、可能是促使外源性EPCs由腫瘤周邊向腫瘤中央?yún)^(qū)域遷移的分子生物學(xué)機(jī)制之一。
　　2、建立大鼠原位腦膠質(zhì)瘤需刺破腦組織，創(chuàng)傷也可導(dǎo)致EPCs向病變區(qū)域歸巢。我們通過建立假腫瘤組，將歸巢的EPCs的數(shù)目與腫瘤組的進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)腫瘤組歸巢的EPCs數(shù)目明顯多于假腫瘤組，證明EPCs主要?dú)w巢至腦膠質(zhì)瘤。同時(shí)，用F4/80染色普魯士藍(lán)陽性細(xì)胞，并未發(fā)現(xiàn)明顯陽性表達(dá)，進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)中普魯士藍(lán)染色陽性的是吞噬了鐵磁顆粒的內(nèi)皮祖細(xì)胞而非巨噬細(xì)胞。