Pokemon對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見、生存率極低的惡性腫瘤，其手術(shù)全切率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且化療、放療療效較差，是嚴(yán)重危害人們健康的惡性腫瘤之一。紅細(xì)胞髓性致癌因子Pokemon(POK erythroid myeloid ontogenic factor)是POK(POZ and Krüppel)轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白家族成員之一，位于許多腫瘤原癌基因和抑癌基因的上游，在癌基因轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵性作用，但目前其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其生物學(xué)特性尚未探明。

2、Survivin是已知凋亡抑制蛋白家族的新成員中重要的癌基因，在膠質(zhì)瘤中普遍高表達(dá)，可以通過阻滯腫瘤細(xì)胞周期和抑制Caspase-3、Caspase-7活性來促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和獲得抗凋亡能力；細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)是由CCNB1基因編碼的一個(gè)細(xì)胞周期蛋白，能有效調(diào)節(jié)高等真核生物的細(xì)胞周期，尤其是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的有絲分裂起始、中后期轉(zhuǎn)換以及有絲分裂退出調(diào)控。但Pokemon對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Survivin、CyclinB1表達(dá)的調(diào)控及影

3、響尚未明確闡明。本研究旨在探討原癌基因Pokemon對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；Pokemon調(diào)控Survivin、CyclinB1的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力的分子機(jī)制。
　　第一部分 Pokemon在膠質(zhì)瘤的表達(dá)及意義
　　目的探討人膠質(zhì)瘤組織、人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系和人膠質(zhì)HEB細(xì)胞系Pokemon的表達(dá)及其變化情況，分析Pokemon在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和分化的關(guān)系，明確膠質(zhì)瘤Poke

4、mon表達(dá)的生物學(xué)意義。
　　方法收集手術(shù)切除的人膠質(zhì)瘤標(biāo)本35例，經(jīng)病理鑒定并按WHO標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，以手術(shù)切除的正常腦組織18例作為對(duì)照。用免疫組化實(shí)驗(yàn)，RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)Pokemon基因的mRNA和蛋白的表達(dá)，分析Pokemon表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的相關(guān)性。用克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察Pokemon表達(dá)對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果正常腦組織中陽性表達(dá)率為16.7％(1/

5、6)，細(xì)胞陽性率為3.2±3.1％。35例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中Pokemon陽性表達(dá)率為82.8％（29/35），其中，星形細(xì)胞瘤Ⅰ級(jí)組織標(biāo)本陽性表達(dá)率為60.0％(3/5)、細(xì)胞陽性率為13±8.5％；星形細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)組織標(biāo)本陽性表達(dá)率為76.9％(10/13)、細(xì)胞陽性率為28.6±10.6％；星形細(xì)胞瘤Ⅲ級(jí)組織標(biāo)本陽性率為83.3％(5/6)、細(xì)胞陽性率為44.5±7.5％；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Ⅳ級(jí)組織標(biāo)本陽性率為100.0％（11/11），細(xì)

6、胞陽性率為59.7±17.9％。Pokemon在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增高而表達(dá)增強(qiáng)（p<0.05）。膠質(zhì)瘤組織Pokemon mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于正常腦組織（p<0.05），膠質(zhì)瘤病理分級(jí)與Pokemon表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.514)。Pokemon基因沉默可顯著降低U251細(xì)胞的增殖速度（p<0.05），顯著減少U251細(xì)胞的克隆形成（p<0.05）。
　　小結(jié)人膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織、U251細(xì)胞系

7、和HEB細(xì)胞系均表達(dá)Pokemon mRNA和蛋白，人膠質(zhì)瘤組織Pokemon mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于人正常腦組織，U251細(xì)胞系Pokemon mRNA和蛋白的表達(dá)顯著高于HEB細(xì)胞系。Pokemon可作為膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的標(biāo)志。Pokemon誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和單克隆的形成。
　　第二部分 Pokemon對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Survivin表達(dá)的影響及機(jī)制
　　目的探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Pokemon對(duì)Survivin

8、表達(dá)的影響和機(jī)制及其與細(xì)胞抗凋亡能力的關(guān)系。
　　方法用RT－PCR和Western Blot觀察人膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織、U251細(xì)胞和HEB細(xì)胞Survivin的表達(dá)、在凋亡誘導(dǎo)藥物TRAIL和CX(塞來昔布－抗腫瘤藥物)預(yù)處理前后，用 MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察 U251細(xì)胞的增殖情況，染色質(zhì)免疫共沉淀和雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析Pokemon與Survivin啟動(dòng)子結(jié)合情況及其活性的影響。
　　結(jié)果人膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織、U

9、251細(xì)胞和HEB細(xì)胞均表達(dá)Survivin mRNA和蛋白，人膠質(zhì)瘤組織和U251細(xì)胞系Survivin mRNA和蛋白均顯著高于正常腦組織和HEB細(xì)胞系（p<0.05或p<0.01）。Pokemon基因沉默可顯著降低U251細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)水平（p<0.05），提高 U251細(xì)胞對(duì)促凋亡藥物 TRAIL和CX的敏感性；高表達(dá)Pokemon蛋白，可誘導(dǎo) Survivin蛋白的表達(dá)（p<0.05），提高 U251細(xì)胞抗凋亡

10、能力；Pokemon對(duì)U251細(xì)胞Survivin表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)具有濃度和時(shí)間依賴性。Pokemon能與Survivin的啟動(dòng)子核心序列(-396~+84bp)直接結(jié)合，并激活Survivin啟動(dòng)子。
　　小結(jié)人膠質(zhì)瘤組織、人膠質(zhì)瘤 U251細(xì)胞、人膠質(zhì) HEB細(xì)胞和正常腦組織均表達(dá)Survivin mRNA和蛋白，人膠質(zhì)瘤組織和人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別顯著高于正常腦組織和人膠質(zhì)HEB細(xì)胞

11、。Pokemon能誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞Survivin的表達(dá),增強(qiáng)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐受性和抗凋亡能力。Pokemon能結(jié)合Survivin啟動(dòng)子核心序列(-396~+84bp)，并激活Survivin啟動(dòng)子，誘導(dǎo)Survivin的表達(dá)。
　　第三部分 Pokemon對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞CyclinB1表達(dá)的影響及機(jī)制
　　目的探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Pokemon對(duì)CyclinB1表達(dá)的影響和機(jī)制及其與細(xì)胞增殖的關(guān)系。

12、
　　方法用MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察U251細(xì)胞的增殖情況，用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期，用RT－PCR和Western Blot觀察U251細(xì)胞CyclinB1的表達(dá)，雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析Pokemon與CyclinB1啟動(dòng)子活性的影響。用柔紅霉素預(yù)處理細(xì)胞，觀察沉默CyclinB1基因后，U251細(xì)胞對(duì)柔紅霉素的敏感性的影響。
　　結(jié)果人膠質(zhì)瘤 U251細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞 HEB均表達(dá)CyclinB1 mRNA，人膠質(zhì)瘤U251

13、細(xì)胞CyclinB1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于膠質(zhì)HEB細(xì)胞。Pokemon高表達(dá)，U251細(xì)胞 CyclinB1 mRNA的表達(dá)水平顯著增高（p<0.05），Pokemon基因沉默，U251細(xì)胞CyclinB1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（p<0.01），Pokemon對(duì)CyclinB1表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)具有時(shí)間依賴性，Pokemon可激活膠質(zhì)瘤 U251細(xì)胞 CyclinB1啟動(dòng)子。沉默 CyclinB1基因能抑制U251細(xì)胞的增殖（

14、p<0.05），誘導(dǎo)U251細(xì)胞增殖阻滯在G2/M期，提高了膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對(duì)柔紅霉素敏感性（p<0.05）。
　　小結(jié)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系和HEB細(xì)胞系均表達(dá)CyclinB1，U251細(xì)胞系CyclinB1表達(dá)水平顯著高于HEB細(xì)胞系。Pokemon可激活CyclinB1的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞CyclinB1的表達(dá)。siRNA-CyclinB1誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖阻滯在G2/M期，提高膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對(duì)柔紅霉

15、素敏感性。
　　結(jié)論
　　1.原癌基因Pokemon、Survivin及CyclinB1在人膠質(zhì)瘤組織和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)。原癌基因Pokemon高表達(dá)可作為膠質(zhì)瘤細(xì)胞病理分級(jí)的重要標(biāo)記。
　　2. Pokemon通過激活Survivin和CyclinB1啟動(dòng)子，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞Survivin和CyclinB1的表達(dá)。
　　3.人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞高表達(dá)的Pokemon可誘導(dǎo)Survivin和Cy